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伤何处

木虫 (正式写手)

[求助] 克隆基因,挑克隆拿去测序,好多点突怎么办!?

两个基因都挑了11个送去测序,之前PCR扩增是22个循环扩的,然后连接载体转化。。测序结果显示,每条都有很多点突怎么办?用的是ExTaq酶

[ Last edited by 伤何处 on 2012-12-13 at 21:15 ]
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
伤何处: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-13 22:04:41
ExTaq不具有校对活性,比较容易出错的。
建议使用高保真酶,如pfu, Pyrobest,phusion等。采用高保真酶,扩增30个循环以内,一般还是可以保证不出错的。
3楼2012-12-13 21:45:17
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主你用的是模板扩增序列然后连接送测序的,
首先,你要保证原始模板没有突变,否则你做PCR时是肯定会有突变的
其次,你需要用高保真的酶,比如pfu, Kod等,楼主的PCR循环控制的很好
祝楼主成功!
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-12-13 21:21:35
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伤何处

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpeng227 at 2012-12-13 21:45:17
ExTaq不具有校对活性,比较容易出错的。
建议使用高保真酶,如pfu, Pyrobest,phusion等。采用高保真酶,扩增30个循环以内,一般还是可以保证不出错的。

我是从cDNA扩增的,直接用pfu可以么?师兄说pfu很难扩出来
对也罢,错也罢;正也罢,逆也罢;通途也好,崎岖无妨……但问,吾心坚否?若坚,纵使歧路,以铁心,贯穿而过,亦为大道!不坚,便是坦途,也难登临绝顶,观险峰
4楼2012-12-13 22:04:21
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 伤何处 at 2012-12-13 22:04:21
我是从cDNA扩增的,直接用pfu可以么?师兄说pfu很难扩出来...

是的,从cDNA里面扩增的,还是用ExTaq比较好,既然有突变,那就能这样了,接下来,你可以将不同克隆之间没有突变的部分拼接起来,酶切的方法,overlap的方法,还有你要查清楚,你所讲的突变,发生率是否高,是不是SNP造成的,如果确定是突变,就想办法把突变修正回来
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2012-12-13 23:11:15
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