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pser2011

银虫 (小有名气)

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[求助] 一个基因做TA克隆后送去测序，不同的单克隆后来结果不一致，1500bp里有的11个碱基不同已有5人参与

金唯智公司测的。基因序列未知，这可用那个构建表达载体呀，大神有知道解决办法的，救命啊！
看了氨基酸的序列，多数单克隆间氨基酸序列一致，这样的话随便挑一个单克隆做还是有什么挑选的规则？

[ Last edited by pser2011 on 2014-3-10 at 21:26 ]

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花儿也在努力地开放！

1楼 2014-03-10 21:03:47

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woolley

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

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pser2011(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-16 14:42:52

1.对于这种情况，首先看一下测序的峰图，确定是否是单峰，是不是背景杂峰比较多，测序公司会把背景杂峰较高的反应也算作成功反应的。
2.将测序结果翻译成蛋白质序列，到NCBI的数据库中去blast，然后看是否有完全一致的比对结果，选择有完全一致比对结果的序列进行后续克隆

一般来说，Taq聚合酶的突变率不会有这么高，1500bp有1到2个克隆算是正常。出现多个测序结果的情况，可能是由于测序结果不好（杂峰导致序列差异），或者是模板不纯（混有多个基因组等），PCR的退火温度太低(45-50度)。

如果可能的话，可以使用Pfu等高保真的酶再做一下