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pser2011

银虫 (小有名气)

[求助] 一个基因做TA克隆后送去测序，不同的单克隆后来结果不一致，1500bp里有的11个碱基不同 已有5人参与

金唯智公司测的。基因序列未知，这可用那个构建表达载体呀，大神有知道解决办法的，救命啊！
看了氨基酸的序列，多数单克隆间氨基酸序列一致，这样的话随便挑一个单克隆做还是有什么挑选的规则？

[ Last edited by pser2011 on 2014-3-10 at 21:26 ]
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花儿也在努力地开放！
1楼 2014-03-10 21:03:47
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2007090351

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这个是很早的帖子了，不知道LZ最后是怎么解决的？是两个克隆都做了表达呢？还是随便挑选了一个？
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9楼2014-10-11 14:54:51
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-11 09:40:22
这差异有点多，你是用什么酶扩的，普通Taq保真性很差，再一个序列分析时要看看测序峰图看看输出的序列对否，测序引物后端50bp左右和测序末端质量很差尽量舍去。
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hehe
2楼2014-03-10 22:23:45
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pser2011(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-16 14:42:31
有几个细节可能引起上述问题：
1. PCR，尽量用保真性好的酶（其实普通Taq酶，一般1.5kb也就可能引起1-2个碱基突变），适当提高退火温度；

2. 如果切胶回收片段，尽量减短紫外照射时间，很可能引起较多突变；

3. 测序结果，最好自己根据峰图拼接选择。
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做一个阳光、开朗的小和尚
3楼2014-03-11 10:51:46
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pser2011(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-16 14:42:52
1.对于这种情况，首先看一下测序的峰图，确定是否是单峰，是不是背景杂峰比较多，测序公司会把背景杂峰较高的反应也算作成功反应的。
2.将测序结果翻译成蛋白质序列，到NCBI的数据库中去blast，然后看是否有完全一致的比对结果，选择有完全一致比对结果的序列进行后续克隆

一般来说，Taq聚合酶的突变率不会有这么高，1500bp有1到2个克隆算是正常。出现多个测序结果的情况，可能是由于测序结果不好（杂峰导致序列差异），或者是模板不纯（混有多个基因组等），PCR的退火温度太低(45-50度)。

如果可能的话，可以使用Pfu等高保真的酶再做一下
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4楼2014-03-11 11:00:49
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