24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 2458  |  回复: 17

snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] TA克隆老是失败,求高人解惑 已有5人参与

我用takara ex taq酶扩增的目的片段,条带大小ok;连接的pUC-T上,再转入E.coli DH5α中,蓝白斑筛选,多数是白色的,挑取单菌落培养5个小时,做菌落PCR(用的是目的基因扩增的引物),结果大部分都有目的条带,于是将它们送去测序。测序见‘结果1’,上面三个样品很好理解为是载体自连的结果,克隆位点后面的序列与载体上相应的位置是一致的;但是下面两个样品克隆位点后面的序列是与载体670-1500左右的序列一致,这该怎么解释呢?

TA克隆老是失败,求高人解惑
结果1.jpg
TA克隆老是失败,求高人解惑-1
结果2.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-23 23:56:39
你的分析策略选的不是很好,测序回来的序列,用软件去除中间的间隔,复制到word里面,用搜索功能搜索你的引物,去掉非目的序列,再做多序列比对。

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-04-21 18:26:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验! 2014-04-23 23:56:29
是不是 感觉自己的目标条带 有一部分转进去了,但是不是全部都进去了? 我也碰到过这些,重新做吧
借口很贱,,,
2楼2014-04-21 17:04:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-21 18:26:46
你的分析策略选的不是很好,测序回来的序列,用软件去除中间的间隔,复制到word里面,用搜索功能搜索你的引物,去掉非目的序列,再做多序列比对。

你是指去除载体等其他的序列吗? 去了以后就没了,测序得到的序列主要都是载体上的
6楼2014-04-21 22:00:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-21 22:00:43
你是指去除载体等其他的序列吗? 去了以后就没了,测序得到的序列主要都是载体上的...

你测序的是空载体,送的克隆不对

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-04-24 06:41:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
snmrna: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议,但是我觉得非特异性条带跟载体上的序列这么多一致,也不可能吧 2014-04-25 13:46:09
引用回帖:
10楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-24 17:24:58
我知道这个载体上没有连接上目的片段 但是为什么跟载体自连的序列会差了200bp呢...

你连上去的可能是非特异条带

[ 发自小木虫客户端 ]
11楼2014-04-24 18:37:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

永远不知道

至尊木虫 (著名写手)

金花家族创始人

【答案】应助回帖

我们都是测序回来的结果直接比较,不行的就重做了
12楼2014-04-24 19:40:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
snmrna: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢你 我重做的时候调整下它们的用量试试看 2014-04-25 13:42:26
自连了,PCR产物回收完了赶快连,T载体用0.3ul就够了 外源50ng可以,还有就是菌落PCR鉴定很不靠谱,负对照一定要有,模板不能用水,要用你涂板子上没有长菌的地方的培养基。
13楼2014-04-25 11:58:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jonew at 2014-04-21 17:04:14
是不是 感觉自己的目标条带 有一部分转进去了,但是不是全部都进去了? 我也碰到过这些,重新做吧

感觉目标条带被置换掉了
3楼2014-04-21 18:18:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jonew

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-21 18:18:32
感觉目标条带被置换掉了...

哪应该就是杂菌污染了?
借口很贱,,,
5楼2014-04-21 21:27:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by jonew at 2014-04-21 21:27:47
哪应该就是杂菌污染了?...

应该不是吧 我在想是不是同源重组了
7楼2014-04-21 22:01:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-21 22:01:35
应该不是吧 我在想是不是同源重组了...

这么好的事不会让你碰上的,老老实实分析吧,别想歪了

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-04-21 22:11:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-24 06:41:28
你测序的是空载体,送的克隆不对
...

我知道这个载体上没有连接上目的片段 但是为什么跟载体自连的序列会差了200bp呢
10楼2014-04-24 17:24:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 snmrna 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料与化工专硕306分找合适调剂 +3 沧海轻舟e 2026-04-06 3/150 2026-04-06 09:41 by 无际的草原
[考研] 调剂 一志愿吉林大学357分 +5 .Starry. 2026-04-04 5/250 2026-04-06 09:28 by cql1109
[考研] 085600,320分求调剂 +16 大馋小子 2026-04-04 17/850 2026-04-06 07:58 by MOF_Catal
[考研] 296求调剂 +3 汪!?! 2026-04-05 4/200 2026-04-05 20:13 by 啵啵啵0119
[考研] 326求调剂 +3 顾若浮生 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:32 by 蓝云思雨
[考研] 272求调剂 +4 电气李 2026-04-05 4/200 2026-04-05 10:41 by lbsjt
[考研] 一志愿郑州大学材料与化工085600,求调剂 +24 吃的不少 2026-04-02 24/1200 2026-04-04 23:20 by 永字号
[考研] 考研调剂 +4 zybz冲冲冲 2026-04-03 6/300 2026-04-04 13:08 by zybz冲冲冲
[考研] 求材料调剂,一志愿郑州大学289分 +15 硕星赴 2026-04-03 15/750 2026-04-04 01:01 by userper
[考研] 学硕机械工程303求调剂 +6 无名所以叫吴明 2026-03-30 7/350 2026-04-03 16:48 by asdfzly
[考研] 求调剂 +4 15064154688 2026-04-03 5/250 2026-04-03 15:07 by zrongyan
[考研] 313求调剂 +3 ~微微凉~ 2026-04-03 3/150 2026-04-03 11:25 by 啵啵啵0119
[考研] 303求调剂 +3 一色清羽 2026-04-02 4/200 2026-04-03 10:22 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿大工学硕,求调剂 +4 yub0811 2026-04-02 4/200 2026-04-02 21:36 by 百灵童888
[考研] 土木304求调剂 +4 兔突突突, 2026-04-02 5/250 2026-04-02 21:16 by 兔突突突,
[考研] 一志愿北京科技材料科学与工程288分,求调剂 +14 是辰啊 2026-04-02 14/700 2026-04-02 21:10 by dongzh2009
[考研] 调剂 +3 好好读书。 2026-04-01 6/300 2026-04-02 15:49 by liumengping
[考研] 286求调剂 +5 Sa67890. 2026-04-01 7/350 2026-04-01 19:50 by 6781022
[考研] 环境工程调剂 +9 hyzzzzzzz. 2026-04-01 9/450 2026-04-01 14:20 by salamander`
[考研] 08工科,295,接受跨专业调剂 +6 lmnlzy 2026-03-31 6/300 2026-04-01 11:02 by 逆水乘风
信息提示
请填处理意见