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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] TA克隆老是失败,求高人解惑 已有5人参与

我用takara ex taq酶扩增的目的片段,条带大小ok;连接的pUC-T上,再转入E.coli DH5α中,蓝白斑筛选,多数是白色的,挑取单菌落培养5个小时,做菌落PCR(用的是目的基因扩增的引物),结果大部分都有目的条带,于是将它们送去测序。测序见‘结果1’,上面三个样品很好理解为是载体自连的结果,克隆位点后面的序列与载体上相应的位置是一致的;但是下面两个样品克隆位点后面的序列是与载体670-1500左右的序列一致,这该怎么解释呢?

TA克隆老是失败,求高人解惑
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-23 23:56:39
你的分析策略选的不是很好,测序回来的序列,用软件去除中间的间隔,复制到word里面,用搜索功能搜索你的引物,去掉非目的序列,再做多序列比对。

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-04-21 18:26:46
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jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验! 2014-04-23 23:56:29
是不是 感觉自己的目标条带 有一部分转进去了,但是不是全部都进去了? 我也碰到过这些,重新做吧
借口很贱,,,
2楼2014-04-21 17:04:14
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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-21 18:26:46
你的分析策略选的不是很好,测序回来的序列,用软件去除中间的间隔,复制到word里面,用搜索功能搜索你的引物,去掉非目的序列,再做多序列比对。

你是指去除载体等其他的序列吗? 去了以后就没了,测序得到的序列主要都是载体上的
6楼2014-04-21 22:00:43
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-21 22:00:43
你是指去除载体等其他的序列吗? 去了以后就没了,测序得到的序列主要都是载体上的...

你测序的是空载体,送的克隆不对

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-04-24 06:41:28
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
snmrna: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议,但是我觉得非特异性条带跟载体上的序列这么多一致,也不可能吧 2014-04-25 13:46:09
引用回帖:
10楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-24 17:24:58
我知道这个载体上没有连接上目的片段 但是为什么跟载体自连的序列会差了200bp呢...

你连上去的可能是非特异条带

[ 发自小木虫客户端 ]
11楼2014-04-24 18:37:35
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永远不知道

至尊木虫 (著名写手)

金花家族创始人

【答案】应助回帖

我们都是测序回来的结果直接比较,不行的就重做了
12楼2014-04-24 19:40:40
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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
snmrna: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢你 我重做的时候调整下它们的用量试试看 2014-04-25 13:42:26
自连了,PCR产物回收完了赶快连,T载体用0.3ul就够了 外源50ng可以,还有就是菌落PCR鉴定很不靠谱,负对照一定要有,模板不能用水,要用你涂板子上没有长菌的地方的培养基。
13楼2014-04-25 11:58:23
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普通回帖

snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jonew at 2014-04-21 17:04:14
是不是 感觉自己的目标条带 有一部分转进去了,但是不是全部都进去了? 我也碰到过这些,重新做吧

感觉目标条带被置换掉了
3楼2014-04-21 18:18:32
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jonew

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-21 18:18:32
感觉目标条带被置换掉了...

哪应该就是杂菌污染了?
借口很贱,,,
5楼2014-04-21 21:27:47
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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by jonew at 2014-04-21 21:27:47
哪应该就是杂菌污染了?...

应该不是吧 我在想是不是同源重组了
7楼2014-04-21 22:01:35
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-21 22:01:35
应该不是吧 我在想是不是同源重组了...

这么好的事不会让你碰上的,老老实实分析吧,别想歪了

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-04-21 22:11:01
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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-24 06:41:28
你测序的是空载体,送的克隆不对
...

我知道这个载体上没有连接上目的片段 但是为什么跟载体自连的序列会差了200bp呢
10楼2014-04-24 17:24:58
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