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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » TA克隆老是失败，求高人解惑
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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] TA克隆老是失败，求高人解惑 已有5人参与

我用takara ex taq酶扩增的目的片段，条带大小ok；连接的pUC-T上，再转入E.coli DH5α中，蓝白斑筛选，多数是白色的，挑取单菌落培养5个小时，做菌落PCR(用的是目的基因扩增的引物)，结果大部分都有目的条带，于是将它们送去测序。测序见‘结果1’，上面三个样品很好理解为是载体自连的结果，克隆位点后面的序列与载体上相应的位置是一致的；但是下面两个样品克隆位点后面的序列是与载体670-1500左右的序列一致，这该怎么解释呢？

TA克隆老是失败，求高人解惑
结果1.jpg
TA克隆老是失败，求高人解惑-1
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1楼 2014-04-21 11:18:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-23 23:56:39
你的分析策略选的不是很好，测序回来的序列，用软件去除中间的间隔，复制到word里面，用搜索功能搜索你的引物，去掉非目的序列，再做多序列比对。

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4楼2014-04-21 18:26:46
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jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-04-23 23:56:29
是不是 感觉自己的目标条带 有一部分转进去了，但是不是全部都进去了？ 我也碰到过这些，重新做吧
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借口很贱，，，
2楼2014-04-21 17:04:14
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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-21 18:26:46
你的分析策略选的不是很好，测序回来的序列，用软件去除中间的间隔，复制到word里面，用搜索功能搜索你的引物，去掉非目的序列，再做多序列比对。

你是指去除载体等其他的序列吗？ 去了以后就没了，测序得到的序列主要都是载体上的
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6楼2014-04-21 22:00:43
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-21 22:00:43
你是指去除载体等其他的序列吗？ 去了以后就没了，测序得到的序列主要都是载体上的...

你测序的是空载体，送的克隆不对

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9楼2014-04-24 06:41:28
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
snmrna: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议，但是我觉得非特异性条带跟载体上的序列这么多一致，也不可能吧 2014-04-25 13:46:09
引用回帖:
10楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-24 17:24:58
我知道这个载体上没有连接上目的片段 但是为什么跟载体自连的序列会差了200bp呢...

你连上去的可能是非特异条带

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11楼2014-04-24 18:37:35
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永远不知道

至尊木虫 (著名写手)

金花家族创始人

【答案】应助回帖

我们都是测序回来的结果直接比较，不行的就重做了
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12楼2014-04-24 19:40:40
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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
snmrna: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢你 我重做的时候调整下它们的用量试试看 2014-04-25 13:42:26
自连了，PCR产物回收完了赶快连，T载体用0.3ul就够了 外源50ng可以，还有就是菌落PCR鉴定很不靠谱，负对照一定要有，模板不能用水，要用你涂板子上没有长菌的地方的培养基。
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13楼2014-04-25 11:58:23
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普通回帖

snmrna

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jonew at 2014-04-21 17:04:14
是不是 感觉自己的目标条带 有一部分转进去了，但是不是全部都进去了？ 我也碰到过这些，重新做吧

感觉目标条带被置换掉了
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3楼2014-04-21 18:18:32
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-21 18:18:32
感觉目标条带被置换掉了...

哪应该就是杂菌污染了？
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借口很贱，，，
5楼2014-04-21 21:27:47
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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jonew at 2014-04-21 21:27:47
哪应该就是杂菌污染了？...

应该不是吧 我在想是不是同源重组了
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7楼2014-04-21 22:01:35
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-21 22:01:35
应该不是吧 我在想是不是同源重组了...

这么好的事不会让你碰上的，老老实实分析吧，别想歪了

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8楼2014-04-21 22:11:01
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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-24 06:41:28
你测序的是空载体，送的克隆不对
...

我知道这个载体上没有连接上目的片段 但是为什么跟载体自连的序列会差了200bp呢
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10楼2014-04-24 17:24:58
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