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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » TA克隆老是失败，求高人解惑
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
snmrna: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议，但是我觉得非特异性条带跟载体上的序列这么多一致，也不可能吧 2014-04-25 13:46:09
引用回帖:
10楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-24 17:24:58
我知道这个载体上没有连接上目的片段 但是为什么跟载体自连的序列会差了200bp呢...

你连上去的可能是非特异条带

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11楼2014-04-24 18:37:35
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永远不知道

至尊木虫 (著名写手)

金花家族创始人

【答案】应助回帖

我们都是测序回来的结果直接比较，不行的就重做了
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12楼2014-04-24 19:40:40
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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
snmrna: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢你 我重做的时候调整下它们的用量试试看 2014-04-25 13:42:26
自连了，PCR产物回收完了赶快连，T载体用0.3ul就够了 外源50ng可以，还有就是菌落PCR鉴定很不靠谱，负对照一定要有，模板不能用水，要用你涂板子上没有长菌的地方的培养基。
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13楼2014-04-25 11:58:23
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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 永远不知道 at 2014-04-24 19:40:40
我们都是测序回来的结果直接比较，不行的就重做了

哦，我知道这个结果肯定是失败了，只是好奇这个‘自连’怎么会是这样，或者不是自连，是别的什么
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14楼2014-04-25 13:44:38
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永远不知道

至尊木虫 (著名写手)

金花家族创始人
引用回帖:
14楼: Originally posted by snmrna at 2014-04-25 13:44:38
哦，我知道这个结果肯定是失败了，只是好奇这个‘自连’怎么会是这样，或者不是自连，是别的什么...

自连就是载体自连上了，这个你需要弄清楚TA克隆的原理，就是载体切开后和目的片段上的T或者A链接，不知道对不对哈，我是这么想的
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15楼2014-04-25 19:16:43
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snmrna

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 永远不知道 at 2014-04-25 19:16:43
自连就是载体自连上了，这个你需要弄清楚TA克隆的原理，就是载体切开后和目的片段上的T或者A链接，不知道对不对哈，我是这么想的...

我知道这个原理，按这个原理自连后测序结果应该就是图一所示的结果，但是图二不知道怎么解释
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16楼2014-04-25 19:35:52
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andywang6137

木虫 (著名写手)
呵呵，上班之后我也遇到过，PCR好好的，TA克隆老不是自己想要的结果。
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17楼2014-04-25 20:58:40
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yyc12596

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我以前做T-A克隆遇见过类似情况。

    白斑个头小，又密集，这种情况挑的克隆测序结果通常都不好。
    最好的板子就是白斑和蓝斑个头都是又大又圆，一个板子上总共十多个斑的时候。

    可以试着换批LB铺板重做。
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18楼2014-04-26 04:14:31
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