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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp
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kittykbh

铜虫 (正式写手)

[求助] TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp 已有6人参与

小妹真心无语了，时隔半年还是同样的结果，之前用的是takara的pmd19-T，现在换了高级的invitrogen TOPO TA clone kit，结果还是这个样子。
求助各位实验大牛。

简单介绍一下，是用mobio Powersoil DNA提取土壤总DNA，然后扩的27f-1492r全长，虽然有点小拖带，但是p出来的主带还是够明亮的，能看出来是一条直线。
用的omgea gel extraction kit做的切胶回收。然后连接转化，氨苄青霉素钠自己溶解的粉末100mg/ul, 板子白色菌落正常，没有糊满板，都是零星单菌落，每板大概50-100个单菌落。
挑菌做菌落pcr， 如下图所示：

其中下板比较亮的是我用Sigma设计的 M13-47/RV-M， 上面小板比较弱的是TOPO自带引物一对M13，结果全都是150bp。

按理说invitrogen TOPO TA克隆用过的人都说不会有几个假阳性的，我这个看起来就是全部假阳性，包括之前做的Takara的载体的情况如出一辙。

我现在觉得是我自己的问题，但是又不清楚是哪个环节出现了问题，或者纯化后的PCR产物有自带载体自连的什么物质？

之前在国内用的天根一套没有一点问题，我现在纠结了这么久，真的快崩溃了~~~

TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp
TOPO TA clone.jpg
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1楼 2015-01-13 22:00:17
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kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuderong at 2015-01-14 13:16:35
用M13引物扩增出来的有一段载体序列，如果扩增得到的片段在150bp左右，那基本都是载体序列，基因没有连到载体上。
你跑电泳跑的时间太短了，marker都没有分开，可以跑远一点再看看。

已经用尽了方法，就是连不上，换了更好的载体也连不上，每次p都是这个效果。只要没在1500bp地方，基本上就再跑也是废品了呀。。。
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5楼2015-01-15 10:27:03
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494118250

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kittykbh(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:07:42
不知道你的片段多长，我的经验是2000片段连接8个小时，3000片段连接12个小时。效果一直很好，我用的就是pmd19和solution one，挑点的时候可以适当多挑几个，片段越长，假阳性越多。希望能对你有帮助

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2楼2015-01-13 22:48:50
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kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 494118250 at 2015-01-13 22:48:50
不知道你的片段多长，我的经验是2000片段连接8个小时，3000片段连接12个小时。效果一直很好，我用的就是pmd19和solution one，挑点的时候可以适当多挑几个，片段越长，假阳性越多。希望能对你有帮助
...

我的片段是1500bp，以前也做过室温半小时连的很好~~~我挑了80个了，都是这样。如果要是没有连上载体的话，会长出来很多白斑吗？我是构建文库的，如果效率太低也没有办法用。
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3楼2015-01-14 13:00:15
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kittykbh(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:07:56
用M13引物扩增出来的有一段载体序列，如果扩增得到的片段在150bp左右，那基本都是载体序列，基因没有连到载体上。
你跑电泳跑的时间太短了，marker都没有分开，可以跑远一点再看看。
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4楼2015-01-14 13:16:35
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