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kittykbh

铜虫 (正式写手)

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8楼: Originally posted by liuderong at 2015-01-15 11:31:54
再核对一下你的引物接头对不对，酶切位点有没有突变？是否和载体对应得上？看能不能换一下酶切位点？按理说酶切连接不会那么难。...

恩，我用的是通用引物，应该存在酶切位点的问题，就是克隆测序，载体上面通用的M13，应该不会变吧

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11楼2015-01-15 13:30:14

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416114799

至尊木虫 (知名作家)

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10楼: Originally posted by kittykbh at 2015-01-15 13:28:55
谢谢解答，我没有做蓝白筛选，因为是建库需要大量阳性克隆，如果只有几个阳性克隆就是失败，何况现在还一条都没有。感受态是invitrogen TOPO TA克隆对应的 TOP10(chemical),切胶的目的条带是非常明亮的。...

不做蓝白斑，失败否否没法判断啊！加个iptg和xgal试试

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做人做事要低调,默默践行心中的梦想.

12楼2015-01-15 14:17:12

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liyaodong164

金虫 (小有名气)

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9楼: Originally posted by kittykbh at 2015-01-15 13:26:02
谢谢指点，还想继续请教一下，切胶时候切下来纯化的目的条带是1500bp，理论上还能混入小片段吗？...

再好的盒子都会有自连，说明书“质控”一栏一般都会给出大概的自连比例。回收过程中高速离心等原因会导致片段断裂，断裂的小片段胶上根本看不见，PCR鉴定的时候总是会有比目的片段小的几百bp的片段，应该就是小片段连入载体。所以，对照你的载体和引物，算一下自连扩出来的应该是多大，如果是150，就是自连，如果小于150，就是小片段。不管怎样，都是你的片段有问题。如若遇到片段纯度浓度都没有问题还是连不进去而对照没有问题，那可能就是更复杂的片段结构的问题了。

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13楼2015-01-16 09:03:19

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