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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp
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kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liuderong at 2015-01-15 11:31:54
再核对一下你的引物接头对不对，酶切位点有没有突变？是否和载体对应得上？看能不能换一下酶切位点？按理说酶切连接不会那么难。...

恩，我用的是通用引物，应该存在酶切位点的问题，就是克隆测序，载体上面通用的M13，应该不会变吧
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11楼2015-01-15 13:30:14
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416114799

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
10楼: Originally posted by kittykbh at 2015-01-15 13:28:55
谢谢解答，我没有做蓝白筛选，因为是建库需要大量阳性克隆，如果只有几个阳性克隆就是失败，何况现在还一条都没有。感受态是invitrogen TOPO TA克隆对应的 TOP10(chemical),切胶的目的条带是非常明亮的。...

不做蓝白斑，失败否否没法判断啊！加个iptg和xgal试试

[ 发自小木虫客户端 ]
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做人做事要低调,默默践行心中的梦想.
12楼2015-01-15 14:17:12
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liyaodong164

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by kittykbh at 2015-01-15 13:26:02
谢谢指点，还想继续请教一下，切胶时候切下来纯化的目的条带是1500bp，理论上还能混入小片段吗？...

再好的盒子都会有自连，说明书“质控”一栏一般都会给出大概的自连比例。回收过程中高速离心等原因会导致片段断裂，断裂的小片段胶上根本看不见，PCR鉴定的时候总是会有比目的片段小的几百bp的片段，应该就是小片段连入载体。所以，对照你的载体和引物，算一下自连扩出来的应该是多大，如果是150，就是自连，如果小于150，就是小片段。不管怎样，都是你的片段有问题。如若遇到片段纯度浓度都没有问题还是连不进去而对照没有问题，那可能就是更复杂的片段结构的问题了。
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13楼2015-01-16 09:03:19
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以换一个胶回收试剂盒试一试，再加上阳性对照，试剂盒里应该有带的对照基因。
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14楼2015-01-17 09:36:01
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gqw616

新虫 (初入文坛)
楼主 你好，我做实验遇到的情况跟你一样，请问这个问题你现在解决了没？我也想请教，谢谢
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15楼2015-05-16 22:15:04
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by kittykbh at 2015-01-15 13:26:02
谢谢指点，还想继续请教一下，切胶时候切下来纯化的目的条带是1500bp，理论上还能混入小片段吗？...

实践能混入，你的问题是在感受态上，可以用bl21  de3的感受态试试，
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采菊东篱下，悠然见南山。
16楼2015-05-16 23:38:43
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kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by gqw616 at 2015-05-16 23:15:04
楼主 你好，我做实验遇到的情况跟你一样，请问这个问题你现在解决了没？我也想请教，谢谢

没有，后来我用半长就连上了
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17楼2015-05-17 19:02:29
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