24小时热门版块排行榜    

查看: 2613  |  回复: 16

kittykbh

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by liuderong at 2015-01-15 11:31:54
再核对一下你的引物接头对不对,酶切位点有没有突变?是否和载体对应得上?看能不能换一下酶切位点?按理说酶切连接不会那么难。...

恩,我用的是通用引物,应该存在酶切位点的问题,就是克隆测序,载体上面通用的M13,应该不会变吧
11楼2015-01-15 13:30:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

416114799

至尊木虫 (知名作家)

引用回帖:
10楼: Originally posted by kittykbh at 2015-01-15 13:28:55
谢谢解答,我没有做蓝白筛选,因为是建库需要大量阳性克隆,如果只有几个阳性克隆就是失败,何况现在还一条都没有。感受态是invitrogen TOPO TA克隆对应的 TOP10(chemical),切胶的目的条带是非常明亮的。...

不做蓝白斑,失败否否没法判断啊!加个iptg和xgal试试

[ 发自小木虫客户端 ]
做人做事要低调,默默践行心中的梦想.
12楼2015-01-15 14:17:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyaodong164

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by kittykbh at 2015-01-15 13:26:02
谢谢指点,还想继续请教一下,切胶时候切下来纯化的目的条带是1500bp,理论上还能混入小片段吗?...

再好的盒子都会有自连,说明书“质控”一栏一般都会给出大概的自连比例。回收过程中高速离心等原因会导致片段断裂,断裂的小片段胶上根本看不见,PCR鉴定的时候总是会有比目的片段小的几百bp的片段,应该就是小片段连入载体。所以,对照你的载体和引物,算一下自连扩出来的应该是多大,如果是150,就是自连,如果小于150,就是小片段。不管怎样,都是你的片段有问题。如若遇到片段纯度浓度都没有问题还是连不进去而对照没有问题,那可能就是更复杂的片段结构的问题了。
13楼2015-01-16 09:03:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以换一个胶回收试剂盒试一试,再加上阳性对照,试剂盒里应该有带的对照基因。
14楼2015-01-17 09:36:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gqw616

新虫 (初入文坛)

楼主 你好,我做实验遇到的情况跟你一样,请问这个问题你现在解决了没?我也想请教,谢谢
15楼2015-05-16 22:15:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by kittykbh at 2015-01-15 13:26:02
谢谢指点,还想继续请教一下,切胶时候切下来纯化的目的条带是1500bp,理论上还能混入小片段吗?...

实践能混入,你的问题是在感受态上,可以用bl21  de3的感受态试试,
采菊东篱下,悠然见南山。
16楼2015-05-16 23:38:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kittykbh

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by gqw616 at 2015-05-16 23:15:04
楼主 你好,我做实验遇到的情况跟你一样,请问这个问题你现在解决了没?我也想请教,谢谢

没有,后来我用半长就连上了
17楼2015-05-17 19:02:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 kittykbh 的主题更新
信息提示
请填处理意见