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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 全长PCR扩增的非特异性条带去不掉咋办
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a406331686

银虫 (小有名气)

[求助] 全长PCR扩增的非特异性条带去不掉咋办已有3人参与

上下引物的TM值分别为43.6和48.2，我用的是44度每个循环降0.5度，一共降12个循环，然后再用38度，跑20个循环，可是电泳后发现目的条带（1000bp处）有，但是没有750bp处的非特异性条带清楚，而且升高退火温度也没作用，求大神指点····

全长PCR扩增的非特异性条带去不掉咋办
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1楼2014-03-25 08:30:29
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-25 13:29:47
把体系做大一点，然后切胶回收大小对的那个片段，之后送测序，对的话就可以了，不用管引物好不好。要是测序不对再考虑引物。
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4楼2014-03-25 12:09:00
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
a406331686: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-03-25 10:19:20
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-25 10:42:04
TM值分别为43.6和48.2
引物的Tm低到40oC，你每条引物各有多少个碱基？
PCR的引物不仅仅要考虑Tm，还要考虑碱基数，因为本质上控制特异性的是碱基长度，
对于人的基因组，引物一般要求至少19个碱基，如果Tm再很低，继续延长，如果Tm已经很高了，为了保证引物的“复杂度”，也应该保持在19个碱基以上。
不然错配是必然的。
但是你这个情况可能比较特殊，你是做克隆，
做克隆只要有自己要的条带就行了
关键是你那个目的条带是不是你要的
如果是的，你就想办法纯化回来一点，再P好了
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2楼2014-03-25 09:22:38
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a406331686

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-25 09:22:38
TM值分别为43.6和48.2
引物的Tm低到40oC，你每条引物各有多少个碱基？
PCR的引物不仅仅要考虑Tm，还要考虑碱基数，因为本质上控制特异性的是碱基长度，
对于人的基因组，引物一般要求至少19个碱基，如果Tm再很低 ...

上下游引物分别为     TGGTTTACAGTTTTACATAC                              GGTACGATGATTCAAACG，上游引物为20个碱基，如果再加碱基的话，引物就有错配了。
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3楼2014-03-25 10:10:47
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shen_41745

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
a406331686: 金币+2, ★有帮助 2014-03-26 18:17:37
你这目的条带看的到而且还比较亮，切胶回收，纯化应该能得到目的带的，然后连T，转大肠，送测序，至于其他的杂带有多亮你就不用管啦
！
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5楼2014-03-26 09:36:25
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