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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Marker条带问题及引物二聚体
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摩都520

铜虫 (小有名气)

[求助] Marker条带问题及引物二聚体 已有1人参与


急急急！！各位亲，求帮帮忙，马上要做QPCR了，可现在用普通PCR验证为QPCR设计的引物现在都是出了问题，怎么办呢！！！！！
1，天根DL2000 Marke为2000bp，如图可看到Marker上面三条带有弯曲，而且弥散厉害，是什么原因呢？。
2，设计的引物，貌似都有二聚体？还是发卡结构？分别用下面八对引物跑的鱼的肝和脂肪组织（图3，肝跑出来，脂肪组织织没跑出来）。
3，这引起引物目的基因的片段都是，101-138之间的，但在，1，3，5跑道有大于远目的基因的片段，为什么？
4，有会oligo软件或NCBI在线BLAST的，能否帮比对下是不是引物的问题。




C1F        GGCAACAGCATCCATTCATT        20        2                HAP
C1R        TGCGTGTGGTGTTGAATATCC        21        2                HAP
C2F        TCCTAGATGACCCTTCACCTC        21        2                HAP
C2R        CCAAAGAGCGTTTATTGACCC        21        2                HAP
C3F        GCCATTCATTCTATCATGCTG        21        2                HAP
C3R        TCGTGTTGAACATACGCTCGT        21        2                HAP
C4F        AAGGGACGTTACTTCAAGGTG        21        2                HAP
C4R        TCCGACTTGTCTGCCAAGAT        20        2                HAP
H1F        CTGGATGTCCATTTCTGGAA        20        2                HAP
H1R        AAGGTCAAAGGTCGCAGGA        19        2                HAP
H2F         TCCACCATCAGCGCACAT         18        2                HAP
H2R        AGCCCCAGGGAAAGAGAGATA        21        2                HAP
ATaF         GGAATCTCTCTCACCCGAGTT        21        2        HAP
ATaR        AATGATGCCACAGTACACTGG        21        2      HAP
ATbF         CCGAGTTACAGACGGAGAAAA        21        2        HAP
ATbR        TGATGCCACAGTACACTGGGA        21        2        HAP
Marker条带问题及引物二聚体
3.jpg
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只做一件事，做绝
1楼 2013-12-08 16:21:22
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lm2570

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-08 17:36:41
1、胶没配好，可能缓冲液有问题，且MARKER上样量太大。
2、有引物二聚体，但不影响。
3、泳道1，3，5有大于远目的基因的片段是非特异片断
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2楼2013-12-08 16:28:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-08 17:36:52
你用的cDNA为模板P的？有大片段可能是gDNA没消化干净，而且引物跨内含子。
这里有个网络版的引物分析，你自己检查一下情况。
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
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3楼2013-12-08 16:52:40
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lm2570 at 2013-12-08 16:28:17
1、胶没配好，可能缓冲液有问题，且MARKER上样量太大。
2、有引物二聚体，但不影响。
3、泳道1，3，5有大于远目的基因的片段是非特异片断

你好，
1，我是用来验证引物的，现在一验证就有二聚体，您说的二聚体没影响，是指用来跑QPCR没影响吗
2，两组织模板都是200ng左右的，上样量为7ul，0.8%的胶。
3，a2f        TCTGATAAAGCTTCGGGCTTC        21
    a2r         ATTTTGCAGTTCCGCTCACA                20
由于这对引物的模板基因我克隆了全长，知道的它的表达丰度比较大，现在做的效果，这对完全ok.也是120左右目的片段无非特异，无二聚体
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只做一件事，做绝
4楼2013-12-09 16:16:20
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-08 16:52:40
你用的cDNA为模板P的？有大片段可能是gDNA没消化干净，而且引物跨内含子。
这里有个网络版的引物分析，你自己检查一下情况。
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/

谢谢,用takala去DNA试剂盒再反转的，我的引物是跨外显子设计的（引物用跨外显子actin跑，均只跑出二聚体）。
1，共有两个预测亚型，然后6个外显子，我用的有第二个外显子和第三个外显子，第四和第五个外显子。
2，知部分序列，共有10个外显子，本引物设计采用第三和第四个外显子来设计。第二对引物以第四个和第五个外显子来设计。
3，共有9个外显子，我测序与相近物种，第二和第三个外显子相似度高，用来设计。
4，网张引物分析好像用不了，老师你是用过吗？
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只做一件事，做绝
5楼2013-12-09 17:20:22
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-24 08:25:39
引物二聚体是正常的，引物过多或者没有扩增出目的带时可以看见。发夹结构的Tm值如果不是太高（30℃以下）问题不大。
适当的引物二聚体和发夹结构可以减少非特异性扩增，如果引物不形成二聚体和适当的发夹结构反而容易扩增出非特异性带。
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6楼2013-12-09 17:49:30
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lizanzan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-24 08:25:43
Maker上样量太大了，一般3.5ul就够了，看实验室有谁在做QPCR,帮你带个样品，检测一下你引物的溶解曲线
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7楼2013-12-09 17:52:58
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

优秀区长优秀区长优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
增长一下电泳时间，看看能不能跑开点。
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轻描淡写，浓墨重彩。
8楼2013-12-09 18:35:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 摩都520 at 2013-12-09 17:20:22
谢谢,用takala去DNA试剂盒再反转的，我的引物是跨外显子设计的（引物用跨外显子actin跑，均只跑出二聚体）。
1，共有两个预测亚型，然后6个外显子，我用的有第二个外显子和第三个外显子，第四和第五个外显子。
2 ...

那个网站应该可以用的。因为你有多对引物，我只试了第一对。是有heterodimer。
跨内含子设计的引物用cDNA模板P出大的条带，可能是gDNA没消化完全。你的引物是否能用，可以先用gDNA为模板摸下条件。
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9楼2013-12-10 03:52:39
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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摩都520(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2013-12-24 08:25:53
用1%的胶试试看，引物二聚体一般情况下多多少少都会有，我觉得这个影响并不是非常大啊。
你可以多设计几对引物一起合成，然后一起P了看看哪个效果好，有时候引物二聚体去不掉但是相对你的产物来说非常淡，那样的话我认为是不影响你的下步实验的。

marker的上样量有点大哦，我们一般只上1UL的marker，这个胶跑得有点……建议你换新的缓冲液，重新做胶，再跑一次。
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10楼2013-12-10 21:01:41
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