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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Marker条带问题及引物二聚体
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摩都520

铜虫 (小有名气)

[求助] Marker条带问题及引物二聚体 已有1人参与


急急急！！各位亲，求帮帮忙，马上要做QPCR了，可现在用普通PCR验证为QPCR设计的引物现在都是出了问题，怎么办呢！！！！！
1，天根DL2000 Marke为2000bp，如图可看到Marker上面三条带有弯曲，而且弥散厉害，是什么原因呢？。
2，设计的引物，貌似都有二聚体？还是发卡结构？分别用下面八对引物跑的鱼的肝和脂肪组织（图3，肝跑出来，脂肪组织织没跑出来）。
3，这引起引物目的基因的片段都是，101-138之间的，但在，1，3，5跑道有大于远目的基因的片段，为什么？
4，有会oligo软件或NCBI在线BLAST的，能否帮比对下是不是引物的问题。




C1F        GGCAACAGCATCCATTCATT        20        2                HAP
C1R        TGCGTGTGGTGTTGAATATCC        21        2                HAP
C2F        TCCTAGATGACCCTTCACCTC        21        2                HAP
C2R        CCAAAGAGCGTTTATTGACCC        21        2                HAP
C3F        GCCATTCATTCTATCATGCTG        21        2                HAP
C3R        TCGTGTTGAACATACGCTCGT        21        2                HAP
C4F        AAGGGACGTTACTTCAAGGTG        21        2                HAP
C4R        TCCGACTTGTCTGCCAAGAT        20        2                HAP
H1F        CTGGATGTCCATTTCTGGAA        20        2                HAP
H1R        AAGGTCAAAGGTCGCAGGA        19        2                HAP
H2F         TCCACCATCAGCGCACAT         18        2                HAP
H2R        AGCCCCAGGGAAAGAGAGATA        21        2                HAP
ATaF         GGAATCTCTCTCACCCGAGTT        21        2        HAP
ATaR        AATGATGCCACAGTACACTGG        21        2      HAP
ATbF         CCGAGTTACAGACGGAGAAAA        21        2        HAP
ATbR        TGATGCCACAGTACACTGGGA        21        2        HAP
Marker条带问题及引物二聚体
3.jpg
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只做一件事，做绝
1楼 2013-12-08 16:21:22
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lm2570 at 2013-12-08 16:28:17
1、胶没配好，可能缓冲液有问题，且MARKER上样量太大。
2、有引物二聚体，但不影响。
3、泳道1，3，5有大于远目的基因的片段是非特异片断

你好，
1，我是用来验证引物的，现在一验证就有二聚体，您说的二聚体没影响，是指用来跑QPCR没影响吗
2，两组织模板都是200ng左右的，上样量为7ul，0.8%的胶。
3，a2f        TCTGATAAAGCTTCGGGCTTC        21
    a2r         ATTTTGCAGTTCCGCTCACA                20
由于这对引物的模板基因我克隆了全长，知道的它的表达丰度比较大，现在做的效果，这对完全ok.也是120左右目的片段无非特异，无二聚体
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只做一件事，做绝
4楼2013-12-09 16:16:20
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查看全部 14 个回答

lm2570

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-08 17:36:41
1、胶没配好，可能缓冲液有问题，且MARKER上样量太大。
2、有引物二聚体，但不影响。
3、泳道1，3，5有大于远目的基因的片段是非特异片断
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2楼2013-12-08 16:28:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-08 17:36:52
你用的cDNA为模板P的？有大片段可能是gDNA没消化干净，而且引物跨内含子。
这里有个网络版的引物分析，你自己检查一下情况。
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
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3楼2013-12-08 16:52:40
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-08 16:52:40
你用的cDNA为模板P的？有大片段可能是gDNA没消化干净，而且引物跨内含子。
这里有个网络版的引物分析，你自己检查一下情况。
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/

谢谢,用takala去DNA试剂盒再反转的，我的引物是跨外显子设计的（引物用跨外显子actin跑，均只跑出二聚体）。
1，共有两个预测亚型，然后6个外显子，我用的有第二个外显子和第三个外显子，第四和第五个外显子。
2，知部分序列，共有10个外显子，本引物设计采用第三和第四个外显子来设计。第二对引物以第四个和第五个外显子来设计。
3，共有9个外显子，我测序与相近物种，第二和第三个外显子相似度高，用来设计。
4，网张引物分析好像用不了，老师你是用过吗？
赞一下 回复此楼
只做一件事，做绝
5楼2013-12-09 17:20:22
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