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cdmmore

铜虫 (小有名气)

[求助] 请大家帮忙看看引物二聚体的问题

下面这张图最右边两个条带是阳性对照，几乎看不到引物二聚体，其余11个是菌落PCR，有大量引物二聚体，并且点样孔也比较亮，请问各位大侠这是什么原因呢？
体系都是一样的，仅模板不同。当时加的单菌落的量比较大，PCR反应液都有点浑浊了，阳性对照模板是菌液，PCR反应液清澈的。大量的引物二聚体是不是和模板量有关系呢？
先谢谢大家啦！

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1楼2013-01-03 22:48:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+2, ★★★★★最佳答案, 非常感谢 2013-01-04 10:37:53
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-01-07 17:01:56
模板量不合适会影响PCR的特异性和扩增效率，如果特异性扩增减少时，引物二聚体的现象就更加严重。所以你的这个现象算是正常。至于点样孔亮的问题也很简单，就是模板中的DNA和蛋白形成复合物，就会跑不下来。这对菌落PCR很难避免的。你后面两个样品估计菌液控制的量比较合适，所以没有明显的引物二聚体，点样孔也比较干净。
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2楼2013-01-04 08:05:46
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-04 08:05:46
模板量不合适会影响PCR的特异性和扩增效率，如果特异性扩增减少时，引物二聚体的现象就更加严重。所以你的这个现象算是正常。至于点样孔亮的问题也很简单，就是模板中的DNA和蛋白形成复合物，就会跑不下来。这对菌落 ...

谢谢谢谢，可是看图上引物二聚体现象严重的扩出来的条带亮度和几乎没有引物二聚体的差不多呢，说明它的特异性扩增也不算少呀？
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3楼2013-01-04 10:37:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-04 10:37:35
谢谢谢谢，可是看图上引物二聚体现象严重的扩出来的条带亮度和几乎没有引物二聚体的差不多呢，说明它的特异性扩增也不算少呀？...

虽然有些泳道看起来是这样。不知道你是否严格控制了上样量。总体上说，特异条带亮的样品引物二聚体要少一些。
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4楼2013-01-04 10:59:33
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-01-04 13:56:08
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 17:02:06
引物二聚体一般长度比较固定，且稳定出现，你这个一会有一会没有，应该不是引物二聚体，而是你模板加的太多了出现了非特异性扩增（与模板其他位置互补），这样才好解释为啥是弥散的条带。

PCR模板一般是加少不加多（当然少也要保证量足够），要给引物和酶重复的反应空间嘛，不然你模板那么多，都没地方反应了
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5楼2013-01-04 13:02:44
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by txw87 at 2013-01-04 13:02:44
引物二聚体一般长度比较固定，且稳定出现，你这个一会有一会没有，应该不是引物二聚体，而是你模板加的太多了出现了非特异性扩增（与模板其他位置互补），这样才好解释为啥是弥散的条带。

PCR模板一般是加少不加 ...

谢谢，有一定道理
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6楼2013-01-07 16:31:43
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