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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 帮忙看下这两个引物有没有问题
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 帮忙看下这两个引物有没有问题

正向引物 5-3：CCGAATTCATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGG
Tm=71.74°    GC含量为51%
反向引物 5-3：GTAATCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGTAGAAAACTTTGTATCCACTCTGTGAACCTTGGCACC
Tm=73.94°     GC含量为38%
哪位大侠帮忙看看这两个引物有没有问题啊，这是我重叠延伸PCR中第二轮PCR的上下游引物，第一轮PCR的A,B片段都P出来了，但是第二轮就是P不出来，退火温度尝试了50°，55°，以及touch down都P不出来，核酸电泳时都在100bp及250bp有很亮的条带。
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1楼 2012-07-20 19:17:50
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-24 14:22:03
你可以适当减少引物的量，一般PCR体系中引物的用量为0.5μL，浓度为10MM，我开始做重叠延伸PCR的时候就是用温度梯度来筛选退火温度的！祝你好运！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
2楼2012-07-24 10:47:58
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生物大虫

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

反向引物有潜在发夹结构，有可能是这个原因吧，100bp左右是引物二聚体吧
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谋事在人成事在天
3楼2012-07-24 11:51:23
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-24 10:47:58
你可以适当减少引物的量，一般PCR体系中引物的用量为0.5μL，浓度为10MM，我开始做重叠延伸PCR的时候就是用温度梯度来筛选退火温度的！祝你好运！

我们一般是加2ul的引物，我们用touch down做了，没结果
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4楼2012-07-24 14:08:28
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polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一个原因可能是反向引物太长了，另一个原因可能跟片断A，B的重叠区序列有关，你可以分析一下重叠区是否有二级结构。
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
5楼2012-07-24 15:24:29
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引物用0.5μL就够了，引物多了反而会导致PCR效果不好！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
6楼2012-07-26 16:28:47
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

想问一下楼主，你的PCR体系是多少的？
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
7楼2012-07-26 16:39:34
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-26 16:39:34
想问一下楼主，你的PCR体系是多少的？

50ul的
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8楼2012-07-26 21:34:46
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