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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 帮忙看下这两个引物有没有问题

正向引物 5-3:CCGAATTCATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGG
Tm=71.74°    GC含量为51%
反向引物 5-3:GTAATCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGTAGAAAACTTTGTATCCACTCTGTGAACCTTGGCACC
Tm=73.94°     GC含量为38%
哪位大侠帮忙看看这两个引物有没有问题啊,这是我重叠延伸PCR中第二轮PCR的上下游引物,第一轮PCR的A,B片段都P出来了,但是第二轮就是P不出来,退火温度尝试了50°,55°,以及touch down都P不出来,核酸电泳时都在100bp及250bp有很亮的条带。
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-24 14:22:03
你可以适当减少引物的量,一般PCR体系中引物的用量为0.5μL,浓度为10MM,我开始做重叠延伸PCR的时候就是用温度梯度来筛选退火温度的!祝你好运!
坚持,就像流星,即使知道最后的结果,也要勇敢的走到最后!
2楼2012-07-24 10:47:58
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生物大虫

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

反向引物有潜在发夹结构,有可能是这个原因吧,100bp左右是引物二聚体吧
谋事在人成事在天
3楼2012-07-24 11:51:23
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-24 10:47:58
你可以适当减少引物的量,一般PCR体系中引物的用量为0.5μL,浓度为10MM,我开始做重叠延伸PCR的时候就是用温度梯度来筛选退火温度的!祝你好运!

我们一般是加2ul的引物,我们用touch down做了,没结果
4楼2012-07-24 14:08:28
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polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一个原因可能是反向引物太长了,另一个原因可能跟片断A,B的重叠区序列有关,你可以分析一下重叠区是否有二级结构。
北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
5楼2012-07-24 15:24:29
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引物用0.5μL就够了,引物多了反而会导致PCR效果不好!
坚持,就像流星,即使知道最后的结果,也要勇敢的走到最后!
6楼2012-07-26 16:28:47
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

想问一下楼主,你的PCR体系是多少的?
坚持,就像流星,即使知道最后的结果,也要勇敢的走到最后!
7楼2012-07-26 16:39:34
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-26 16:39:34
想问一下楼主,你的PCR体系是多少的?

50ul的
8楼2012-07-26 21:34:46
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