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NanHao1991铜虫 (初入文坛)
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[求助]
PCR没有条带，求助 已有3人参与
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序列如下： atgtctttgaacgactttcaaaagcaacaaaagcaggccgctcccaaaccaaagaagactttgaagcttgtctccagttccggtatcaagttggccaatgctaccaagaaggttggcacaaaacctgccgaatctgataagaaagaggaagagaagtctgctgaaaccaaagaaccaactaaagagccaacaaaggtcgaagaaccagttaaaaaggaggagaaaccagtccagactgaagaaaagacggaggaaaaatcggaacttccaaaggtagaagaccttaaaatctctgaatcaacacataataccaacaatgccaatgttaccagtgctgatgccttgatcaaggaacaggaagaagaagtggatgacgaagttgttaacgatatgtttggtggtaaagatcacgtttctttaattttcatgggtcatgttgatgccggtaaatctactatgggtggtaatctactatacttgactggctctgtggataagagaactattgagaaatatgaaagagaagccaaggatgcaggcagacaaggttggtacttgtcatgggtcatggataccaacaaagaagaaagaaatgatggtaagactatcgaagttggtaaggcctactttgaaactgaaaaaaggcgttataccatattggatgctcctggtcataaaatgtacgtttccgagatgatcggtggtgcttctcaagctgatgttggtgttttggtcatttccgccagaaagggtgagtacgaaaccggttttgagagaggtggtcaaactcgtgaacacgccctattggccaagacccaaggtgttaataagatggttgtcgtcgtaaataagatggatgacccaaccgttaactggtctaaggaacgttacgaccaatgtgtgagtaatgtcagcaatttcttgagagcaattggttacaacattaagacagacgttgtatttatgccagtatccggctacagtggtgcaaatttgaaagatcacgtagatccaaaagaatgcccatggtacaccggcccaactctgttagaatatctggatacaatgaaccacgtcgaccgtcacatcaatgctccattcatgttgcctattgccgctaagatgaaggatctaggtaccatcgttgaaggtaaaattgaatccggtcatatcaaaaagggtcaatccaccctactgatgcctaacaaaaccgctgtggaaattcaaaatatttacaacgaaactgaaaatgaagttgatatggctatgtgtggtgagcaagttaaactaagaatcaaaggtgttgaagaagaagacatttcaccaggttttgtactaacatcgccaaagaaccctatcaagagtgttaccaagtttgtagctcaaattgctattgtagaattaaaatctatcatagcagccggtttttcatgtgttatgcatgttcatacagcaattgaagaggtacatattgttaagttattgcacaaattagaaaagggtaccaaccgtaagtcaaagaaaccacctgcttttgctaagaagggtatgaaggtcatcgctgttttagaaactgaagctccagtttgtgtggaaacttaccaagattaccctcaattaggtagattcactttgagagatcaaggtaccacaatagcaattggtaaaattgttaaaattgccgagtaatc 上游引物： aacaggatccatgtcggattcaaacTCTAGAtctGAATTCatgtctttgaacgact 注：aacaggatccatgtcggattcaaacTCTAGAtctGAATTC是添加的酶切位点和一段多肽； 下游引物： ggcggGAgctctTgattactcggc 该对引物怎么做都做不出来，试过各种条件，后来发现是上游引物3’端有发夹结构。 于是，将上游引物拆成F1和F2两个引物，如下： F-1 tcaaacTCTAGAtctGAATTCatgtctttgaacgact F-2 aacaggatccatgtcggattcaaacTCTAGAtctG 策略是: 1. 用F1和R扩增出短序列（红色）； 2. 用上步产物做模板，用F2和R扩增出长序列（蓝色）。 目前卡在1了，死活扩增不出短序列。跑胶结果显示引物区域很亮，引物都在内耗啊。。。 这是怎么回事啊，是引物设计的问题吗？有没有哪位能帮忙看下引物啊，虽然有些互补但都是必要序列没办法修改的。多谢多谢！  图片1.png |
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