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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请帮忙看看我用primer5设计的引物是否有问题？？
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l20065091

新虫 (初入文坛)

[求助] 请帮忙看看我用primer5设计的引物是否有问题？？

用primer5设计出的一对引物如下图，送去引物公司合成后pcr扩增结果失败没有条带产生，只有二聚体，请问这是什么原因？是引物设计的问题还是其他什么问题，序列来自GENEBANK！！
这是反向引物



正向引物
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1楼 2012-07-01 09:25:20
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引物设计我认为是没问题的，万一是合成有问题或者后来降解了，那就很难说了。PCR扩增无产物的原因实在太多了，不一一说了。如果不是上面的原因，那么就慢慢检查吧，首先保证模板ok，然后试剂ok。设置好各种对照，争取一次PCR多分析几个因素吧。
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5楼2012-07-02 05:27:12
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 西瓜斑斑辛苦 2012-07-02 13:45:06
引物应该是没问题的。
你的产物才160bp，跟引物二聚体的位置会很接近，可能有条带但是你没看出来。建议你再做一次PCR，加个无模板的空白对照，两个产物放胶上一跑就很容易看了！
另外，由于产物很小，所以跑胶时间太长，产物跑到胶外去了也是很有可能的！
最后，无图无真相，楼主还是把电泳图也贴上来吧
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2012-07-02 05:22:53
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普通回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-02 13:44:43
1：楼主最好把你要P的目的基因全长片段贴出来，这样有利于分析.
2：影响扩增的因素很多，比如酶，模板，PCR体系，PCR条件，楼主最好把这些也贴一下，这样综合考虑才能知道到底是哪出问题了.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-01 22:22:17
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第五平原

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
也有可能是你的扩增体系有问题，比如你调整一下退火温度试试。
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勤勉
3楼2012-07-01 22:34:57
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kaikal

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-04 13:47:31
真心觉得引物没什么问题，如果你信不过的话把后引物的GC含量在提高一点，然后去BLAST一下，看看这两个引物是不是在测定的基因上
假如都没问题的话，我建议楼主改变一下实验反应条件！祝楼主实验顺利！
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加油！！！
6楼2012-07-02 14:21:33
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流氓有文化

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的产物太小了，建议你用2.0的胶，大板跑
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7楼2012-07-02 17:40:16
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l20065091

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-01 22:22:17
1：楼主最好把你要P的目的基因全长片段贴出来，这样有利于分析.
2：影响扩增的因素很多，比如酶，模板，PCR体系，PCR条件，楼主最好把这些也贴一下，这样综合考虑才能知道到底是哪出问题了.

目的基因片段我附在了附件里面咯，附件里的TXT文件就是我所设计引物的目的基因，是SSR相关的序列。
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8楼2012-07-04 10:04:04
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l20065091

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 第五平原 at 2012-07-01 22:34:57
也有可能是你的扩增体系有问题，比如你调整一下退火温度试试。

我做PCR都先用的温度梯度扩增的，什么也没出来！！
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9楼2012-07-04 10:04:42
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l20065091

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-07-02 05:22:53
引物应该是没问题的。
你的产物才160bp，跟引物二聚体的位置会很接近，可能有条带但是你没看出来。建议你再做一次PCR，加个无模板的空白对照，两个产物放胶上一跑就很容易看了！
另外，由于产物很小，所以跑胶时间 ...

空白对照每次都做的，补上电泳图片！！
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10楼2012-07-04 10:05:20
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