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jack_1128铁杆木虫 (正式写手)
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[求助]
求助如何测血红蛋白和血红蛋白二聚体？用什么来表示？
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大家好！ 我不太懂有机和分析，想请教一下各位，我想测一下我的血红蛋白溶液中是否有血红蛋白二聚体，该如测量？ 注：血红蛋白是四聚体，分子量64500；血红蛋白四聚体会慢慢解聚成二聚体，二聚体的分子量为32000左右。我用什么方法能看出血红蛋白溶液中有没有血红蛋白二聚体？ 谢谢大家！请多多指教！！！ |
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lilost
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【答案】应助回帖
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1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 免疫比浊法采用美国IL公司生产的ACL TOP全自动血凝仪及其配套DD检测试剂（批号：B50317）； 1.1.2 胶体金法采用挪威AxisShield公司生产的Nycocard Reader 血浆DD检测光度计，及配套DD胶体金免疫渗滤试剂盒（批号：10122111）。 1.1.3 干扰物：胆红素标准品（上海科华公司生产，批号：GF 62 K）、脂肪乳（主要成分为甘油三酯，华瑞制药有限公司生产，批号：0510019）、血红蛋白（日本国际试药株式会社）。 1.2 标本 1.2.1 质控品：IL公司提供的正常及高值质控血浆； 1.2.2 血样：随机抽取住院病人及健康体检人群新鲜全血，用109 mmol/L枸橼酸钠抗凝， 3 000 r/min离心10 min，取得乏血小板血浆，3 h内完成检测。 1.3 方法 1.3.1 重复性实验（批内精密度）：根据CLSI的EP5A2文件[2]对于精密度评价的要求，分别采用免疫比浊法和胶体金法，在ACL TOP血凝仪与Nycocard Reader 光度计上测定正常及高值水平质控血浆DD含量。3 h内各水平连续测定20次，计算均值（）、标准差（s）、变异系数（CV）。 1.3.2 稳定性实验（日间精密度） 按上述方法，分别测定正常及高值质控血浆DD含量，每天测定1次，连续测定20 d，计算、s、CV。 1.3.3 线性实验 根据CLSI [3]对线性评价的要求及免疫比浊法和胶体金法各自的线性范围，选取DD的高值和低值病人标本，低值标本为1号，高值标本为5号，二者3∶1混合为2号，等份混合为3号，1∶3混合为4号，制备成5个浓度梯度的样品，每个浓度样品重复检测4次，根据检测结果进行线性回归分析。 1.3.4 生物性物质干扰实验 根据CLSI EP7A文件[4]对干扰实验的相关要求，在体外向正常人混合血浆中加入不同浓度胆红素、脂肪乳、血红蛋白，加入的最高浓度参考临床标本可能出现的最高含量及试剂说明书的说明。分别使用免疫比浊法和胶体金法测定混合血浆，根据加入干扰物质前后的测定值计算影响度。 影响度=（加入后测定值-加入前测定值）/加入前测定值×100%。 1.3.5 比对实验 根据CLSI EP9A2文件[5]对能力比对的相关要求，选取随机的住院病人新鲜全血标本40例，采用上述两种方法平行检测DD含量，每天8例血浆，连续检测5 d。最后对检测结果进行相关性分析。 1.3.6 免疫比浊法与胶体金法DIC诊断效能的评价与比较：收集129例临床疑为DIC的患者标本，分别采用两种方法检测其FDP含量，以1999年全国DIC诊断标准修订方案作为确诊标准[6]，由此评价与比较两种方法的诊断效能，包括受试者工作特征曲线（Receiver operating Characteristic Curve，ROC）、敏感度、特异度等。 1.4 统计学方法 线性评价中根据理论值与实测值做相关曲线及回归方程，获得相关系数、截距、斜率等参数；DIC诊断效能评价中采用四格表计算敏感度、特异度。以上处理及ROC绘制均使用SPSS 11.0软件分析。 |
2楼2011-10-18 11:09:01
jack_1128
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3楼2011-10-18 11:13:51
【答案】应助回帖
jack_1128(金币+2, 博学EPI+1): 不好意思，这个不懂，从来没做过计算方面的东西，谢谢了！！！ 2011-10-18 14:37:36
| 使用Insight II 分子模拟软件包(Biosym Inc. , SanDiego , CA) 完成。溶剂可及表面积的计算采用Lee等定义的空间填充模型按照与bHb 溶剂可及表面积计算相同的方法进行。血红蛋白以二聚体形式存在,血红蛋白αβ二聚体进行了模拟研究。PEG修饰物分布在pHb 表面的形态是设计的关键。PEG修饰物在pHb 表面分布采用分子动力学方法模拟。由于PEG分子是高分子化合物,分子量大,直接对PEG 修饰pHb 作动力学计算存在较大困难, 选用20 个聚乙二醇结构单元的链状化合物作为模板,通过合理设计的连接物连接到可能被修饰的pHb 表面Lys 上,进行分子动力学计算，模拟PEG修饰pHb 表面行为。在作分子动力学计算之前,先通过分子力学优化消除不合理结构,然后进行100 ps 的分子动力学计算,获得模拟物的结构。pHbαβ二聚体中共有13 个Lys 适合通过合适的连接物进行PEG修饰,选择分子量大约5 kD 左右的PEG分子,可控制修饰后的pHb 分子不从肾小球滤过。PEG修饰pHb 对pHb 氧结合部位不会有影响,pHb 携氧能力将得到保持。pHb和bHb 的Lys 的保守性及其氨基的可及性表明修饰部位可能不同,保守的氨基酸性质可能会有一定的差别。使用计算机辅助合理设计的连接物可将PEG在温和条件下连接到pHb 上。 |
4楼2011-10-18 12:34:50
5楼2011-10-18 14:06:34
jack_11286楼2011-10-18 14:45:46
jack_1128
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7楼2011-10-18 19:04:47
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ocean1982
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