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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Marker条带问题及引物二聚体
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摩都520

铜虫 (小有名气)

[求助] Marker条带问题及引物二聚体 已有1人参与


急急急！！各位亲，求帮帮忙，马上要做QPCR了，可现在用普通PCR验证为QPCR设计的引物现在都是出了问题，怎么办呢！！！！！
1，天根DL2000 Marke为2000bp，如图可看到Marker上面三条带有弯曲，而且弥散厉害，是什么原因呢？。
2，设计的引物，貌似都有二聚体？还是发卡结构？分别用下面八对引物跑的鱼的肝和脂肪组织（图3，肝跑出来，脂肪组织织没跑出来）。
3，这引起引物目的基因的片段都是，101-138之间的，但在，1，3，5跑道有大于远目的基因的片段，为什么？
4，有会oligo软件或NCBI在线BLAST的，能否帮比对下是不是引物的问题。




C1F        GGCAACAGCATCCATTCATT        20        2                HAP
C1R        TGCGTGTGGTGTTGAATATCC        21        2                HAP
C2F        TCCTAGATGACCCTTCACCTC        21        2                HAP
C2R        CCAAAGAGCGTTTATTGACCC        21        2                HAP
C3F        GCCATTCATTCTATCATGCTG        21        2                HAP
C3R        TCGTGTTGAACATACGCTCGT        21        2                HAP
C4F        AAGGGACGTTACTTCAAGGTG        21        2                HAP
C4R        TCCGACTTGTCTGCCAAGAT        20        2                HAP
H1F        CTGGATGTCCATTTCTGGAA        20        2                HAP
H1R        AAGGTCAAAGGTCGCAGGA        19        2                HAP
H2F         TCCACCATCAGCGCACAT         18        2                HAP
H2R        AGCCCCAGGGAAAGAGAGATA        21        2                HAP
ATaF         GGAATCTCTCTCACCCGAGTT        21        2        HAP
ATaR        AATGATGCCACAGTACACTGG        21        2      HAP
ATbF         CCGAGTTACAGACGGAGAAAA        21        2        HAP
ATbR        TGATGCCACAGTACACTGGGA        21        2        HAP
Marker条带问题及引物二聚体
3.jpg
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只做一件事，做绝
1楼 2013-12-08 16:21:22
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-24 08:25:39
引物二聚体是正常的，引物过多或者没有扩增出目的带时可以看见。发夹结构的Tm值如果不是太高（30℃以下）问题不大。
适当的引物二聚体和发夹结构可以减少非特异性扩增，如果引物不形成二聚体和适当的发夹结构反而容易扩增出非特异性带。
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6楼2013-12-09 17:49:30
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lm2570

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-08 17:36:41
1、胶没配好，可能缓冲液有问题，且MARKER上样量太大。
2、有引物二聚体，但不影响。
3、泳道1，3，5有大于远目的基因的片段是非特异片断
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2楼2013-12-08 16:28:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-08 17:36:52
你用的cDNA为模板P的？有大片段可能是gDNA没消化干净，而且引物跨内含子。
这里有个网络版的引物分析，你自己检查一下情况。
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
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3楼2013-12-08 16:52:40
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摩都520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lm2570 at 2013-12-08 16:28:17
1、胶没配好，可能缓冲液有问题，且MARKER上样量太大。
2、有引物二聚体，但不影响。
3、泳道1，3，5有大于远目的基因的片段是非特异片断

你好，
1，我是用来验证引物的，现在一验证就有二聚体，您说的二聚体没影响，是指用来跑QPCR没影响吗
2，两组织模板都是200ng左右的，上样量为7ul，0.8%的胶。
3，a2f        TCTGATAAAGCTTCGGGCTTC        21
    a2r         ATTTTGCAGTTCCGCTCACA                20
由于这对引物的模板基因我克隆了全长，知道的它的表达丰度比较大，现在做的效果，这对完全ok.也是120左右目的片段无非特异，无二聚体
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只做一件事，做绝
4楼2013-12-09 16:16:20
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