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7baby1990

新虫 (初入文坛)

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[求助] 16srRNA基因PCR扩增条带总出现在最下方什么原因？

是鱼类腐败细菌，引物为通用引物27F和1492R，出现这样的情况是什么原因？求高人解答

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1楼 2013-04-27 19:07:51

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

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7baby1990(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-28 13:49:42
7baby1990: 金币+1, ★有帮助 2013-04-28 23:23:53

引用回帖:

4楼: Originally posted by 7baby1990 at 2013-04-28 12:58:18
DNA2ul，buffer2.5ul，mgcl 2ul，dNTP 2ul ，上游引物3ul，下游引物3ul，taq酶0.3ul，双蒸水10.2ul，总体积25ul，94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，72℃后续延伸10min

2.JPG
...

最好跑个marker。感觉就是没P出来。下面亮的可能是引物二聚体。模板DNA定浓度了吗？引物的浓度是多少？

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5楼2013-04-28 13:48:12

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

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7baby1990: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-04-29 14:31:23
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-04-29 21:45:42

引用回帖:

8楼: Originally posted by 7baby1990 at 2013-04-28 23:27:28
应该是没出来，模板DNA浓度没有定，引物浓度是10pmol/ml...

DNA如果可能的话最好可能定一下大致的浓度。模板太多或者太少都对PCR的结果影响很大。用的是基因组DNA吗？nanodrop很容易测的，不行的话跑胶也可以检测到微克级别的基因组DNA。
此外，引物浓度一般是10μM=10pmol/μl。我觉得实在不可能是差1000倍。最终的引物在PCR体系里是0.1-1μM。我感觉你的引物用的有些多。
引物的退火温度与PCR体系里的镁离子浓度有关，常用的镁离子终浓度是1.5mM。不知道你使用的镁离子stock的浓度，你可以检查一下终浓度是否合适。不行的话你可以试试降低退火温度。

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11楼2013-04-29 00:30:36

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