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7baby1990

新虫 (初入文坛)

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[求助] 16srRNA基因PCR扩增条带总出现在最下方什么原因？

是鱼类腐败细菌，引物为通用引物27F和1492R，出现这样的情况是什么原因？求高人解答

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1楼 2013-04-27 19:07:51

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
7baby1990: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-04-29 14:31:23
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-04-29 21:45:42

引用回帖:

8楼: Originally posted by 7baby1990 at 2013-04-28 23:27:28
应该是没出来，模板DNA浓度没有定，引物浓度是10pmol/ml...

DNA如果可能的话最好可能定一下大致的浓度。模板太多或者太少都对PCR的结果影响很大。用的是基因组DNA吗？nanodrop很容易测的，不行的话跑胶也可以检测到微克级别的基因组DNA。
此外，引物浓度一般是10μM=10pmol/μl。我觉得实在不可能是差1000倍。最终的引物在PCR体系里是0.1-1μM。我感觉你的引物用的有些多。
引物的退火温度与PCR体系里的镁离子浓度有关，常用的镁离子终浓度是1.5mM。不知道你使用的镁离子stock的浓度，你可以检查一下终浓度是否合适。不行的话你可以试试降低退火温度。