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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 16srRNA基因PCR扩增条带总出现在最下方什么原因？
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7baby1990

新虫 (初入文坛)

[求助] 16srRNA基因PCR扩增条带总出现在最下方什么原因？

是鱼类腐败细菌，引物为通用引物27F和1492R，出现这样的情况是什么原因？求高人解答
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1楼 2013-04-27 19:07:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
7baby1990(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-28 13:49:42
7baby1990: 金币+1, ★有帮助 2013-04-28 23:23:53
引用回帖:
4楼: Originally posted by 7baby1990 at 2013-04-28 12:58:18
DNA2ul，buffer2.5ul，mgcl 2ul，dNTP 2ul ，上游引物3ul，下游引物3ul，taq酶0.3ul，双蒸水10.2ul，总体积25ul，94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，72℃后续延伸10min

2.JPG
...

最好跑个marker。感觉就是没P出来。下面亮的可能是引物二聚体。模板DNA定浓度了吗？引物的浓度是多少？
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5楼2013-04-28 13:48:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
7baby1990: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-04-29 14:31:23
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-04-29 21:45:42
引用回帖:
8楼: Originally posted by 7baby1990 at 2013-04-28 23:27:28
应该是没出来，模板DNA浓度没有定，引物浓度是10pmol/ml...

DNA如果可能的话最好可能定一下大致的浓度。模板太多或者太少都对PCR的结果影响很大。用的是基因组DNA吗？nanodrop很容易测的，不行的话跑胶也可以检测到微克级别的基因组DNA。
此外，引物浓度一般是10μM=10pmol/μl。我觉得实在不可能是差1000倍。最终的引物在PCR体系里是0.1-1μM。我感觉你的引物用的有些多。
引物的退火温度与PCR体系里的镁离子浓度有关，常用的镁离子终浓度是1.5mM。不知道你使用的镁离子stock的浓度，你可以检查一下终浓度是否合适。不行的话你可以试试降低退火温度。
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11楼2013-04-29 00:30:36
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
什么情况，图呢？
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2楼2013-04-28 03:19:53
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7baby1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-28 03:19:53
什么情况，图呢？

不知道如何插图
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3楼2013-04-28 12:50:27
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7baby1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-28 03:19:53
什么情况，图呢？

DNA2ul，buffer2.5ul，mgcl 2ul，dNTP 2ul ，上游引物3ul，下游引物3ul，taq酶0.3ul，双蒸水10.2ul，总体积25ul，94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，72℃后续延伸10min

2.JPG
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4楼2013-04-28 12:58:18
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senix

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
7baby1990: 金币+1, ★有帮助 2013-04-28 23:24:25
这个是引物二聚体，引物或者PCR条件不对！
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做实验就是和上帝玩游戏！
6楼2013-04-28 15:26:02
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
7baby1990: 金币+1 2013-04-28 23:24:42
你的退火温度太高了，一般我用49度
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啊木
7楼2013-04-28 15:27:16
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7baby1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-28 13:48:12
最好跑个marker。感觉就是没P出来。下面亮的可能是引物二聚体。模板DNA定浓度了吗？引物的浓度是多少？...

应该是没出来，模板DNA浓度没有定，引物浓度是10pmol/ml
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8楼2013-04-28 23:27:28
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7baby1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by billtsu at 2013-04-28 15:27:16
你的退火温度太高了，一般我用49度

49度会不会低了，我那个引物单子上上游引物27f的Tm是60度，下游引物1492r的Tm是57度好像
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9楼2013-04-28 23:29:55
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7baby1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by senix at 2013-04-28 15:26:02
这个是引物二聚体，引物或者PCR条件不对！

不知道该如何改进
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10楼2013-04-28 23:34:35
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