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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 16srDNA PCR扩增问题，帮忙分析下原因
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bear0329

金虫 (正式写手)

[求助] 16srDNA PCR扩增问题，帮忙分析下原因

PCR体系：     总体积                 30 μl
10×Buffer                                 3 μl
dNTP(0.25 mM)                        1.5 μl
Taq DNA polymerase                0.3 μl
27F(25μM)                               1 μl
907R(25μM)                            1 μl
BSA                                         0.2 μl
模板DNA                                 1 μl
ddH2O                                   22 μl
PCR程序：
94℃预变性3min，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s，32个循环，72℃延伸10min。
PCR结果：

    昨天根据虫友的分析，我将dNTP由原来的0.5 μl改为1.5 μl
退火温度由54度改为50度，目的条带扩增效率很好，但是有很多非特异性扩增，请虫友指点，小虫不甚感激！先谢谢各位了！

[ Last edited by bear0329 on 2011-6-15 at 21:35 ]
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以马内利！
1楼 2011-06-15 21:32:17
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★ ★
bear0329(金币+1): 谢谢 2011-06-16 07:16:01
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-06-16 10:58:53
bear0329(金币+1): 谢谢 2011-06-16 22:54:29
引物加多了要减少，退火温度低了导致特异性下降。延伸时间长了要减少，循环数多了，要减少。
赞一下(1人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-06-15 22:14:35
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niyq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
bear0329(金币+1): 谢谢 2011-06-16 07:16:15
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-06-16 10:59:01
提高复性温度是关键，引物浓度可降低。再试试
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-06-15 22:58:50
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lbzx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
bear0329(金币+1): 恩，再试试 2011-06-16 10:39:59
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-06-16 10:59:12
用55度退火，再扩
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-06-16 10:28:17
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harben

银虫 (初入文坛)
做降落PCR试试。
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5楼2011-06-17 09:38:50
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