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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 16srDNA扩增问题，急
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bear0329

金虫 (正式写手)

[求助] 16srDNA扩增问题，急

PCR体系
     总体积                 30 μl
10×Buffer              3 μl
dNTP(0.25 mM)          0.5 μl
Taq DNA polymerase      0.3 μl
27F(25μM)              1 μl
907R(25μM)             1 μl
BSA                    0.2 μl
模板DNA               1 μl
ddH2O                  13 μl
PCR程序
94℃预变性3min，94℃变性1min，54℃退火45s，72℃延伸90s，32个循环，72℃延伸10min。
PCR结果：

怎么有的扩增了有的没有扩增到啊，提取的时候都是有的。PCR体系和程序有什么问题吗？还有就是，PCR产物ED染色后跑胶检测，开始就拍到上图，过了一会连MARKER都很淡了，这又是为什么啊？谢谢了

[ Last edited by bear0329 on 2011-6-13 at 21:16 ]
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以马内利！
1楼 2011-06-13 21:14:03
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lbzx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
bear0329(金币+1): 谢谢你啊~很有用，明天试试~ 2011-06-13 23:20:32
西瓜(金币+3): Good 2011-06-13 23:58:05
1、DNTP 加到2ul
2、模板稀释20倍好了
3、用EB染色的吧，浓度加大
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2楼2011-06-13 21:36:22
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bear0329

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lbzx at 2011-06-13 21:36:22:
1、DNTP 加到2ul
2、模板稀释20倍好了
3、用EB染色的吧，浓度加大

谢谢啊，程序问题不大吧？
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以马内利！
3楼2011-06-13 21:42:05
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
关于条带变淡的问题，那是因为看胶时时用紫外照射的，而紫外线会使DNA降解，故在紫外线照射下条带会逐渐变淡。下次操作最好快点噢。
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4楼2011-06-13 23:59:53
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bear0329

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-06-13 23:59:53:
关于条带变淡的问题，那是因为看胶时时用紫外照射的，而紫外线会使DNA降解，故在紫外线照射下条带会逐渐变淡。下次操作最好快点噢。

谢谢斑竹啊
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以马内利！
5楼2011-06-14 08:36:39
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
bear0329(金币+1): 谢谢啦 2011-06-14 10:18:20
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-06-14 22:33:56
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-06-13 23:59:53:
关于条带变淡的问题，那是因为看胶时时用紫外照射的，而紫外线会使DNA降解，故在紫外线照射下条带会逐渐变淡。下次操作最好快点噢。

拍胶不就1、2分钟的事，有就有，没有就是没有，不会要很久吧，如果是你说的情况，得紫外灯一直开着，那对仪器也不好吧。可以试试改变退火温度的吧
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6楼2011-06-14 09:50:34
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good 2011-06-14 22:34:09
94℃  45s，50-58℃（可以尝试一下改变退火温度）45s，72℃ 1min30s，30 cycles，仅供参考
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7楼2011-06-14 09:53:40
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zgk0205

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 模板问题说得很有道理啊。不过Maker问题，楼主的意思是说刚拍照时候正常，时间久了maker变淡呢。 2011-06-14 22:39:55
稀释1倍没扩增到条带，稀释50倍又有条带了，说明DNA提取液中含有较多对Taq酶产生抑制的抑制剂，需检查DNA提取方法。
marker都没了，可能跟点样有点关系，点样的时候DNA没有沉到点样孔的底部，造成跑胶的时候溢出，点样前，DNA要与loading buffer充分混合，并且buffer中的甘油含量要合适，保证与DNA混合后不让DNA在点样孔中飘散而是沉到点样孔底部。
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凝练
8楼2011-06-14 15:59:21
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)
★ ★
西瓜(金币+2): 欢迎交流。我们实验室的loading buffer都自己配呢，嘿嘿～ 2011-06-14 22:40:44
一般实验室用的电泳loading buffer都是MARKER的时候配送的吧，所以甘油含量改变一说应该不适用于LZ，
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9楼2011-06-14 16:28:05
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JessieDai

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 同意。 2011-06-14 22:37:39
增高退火温度，特异性增加，但是量会减少，降低温度，量增加，特异性降低
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10楼2011-06-14 16:46:58
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