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bear0329

金虫 (正式写手)

[求助] 16srDNA扩增问题,急

PCR体系
     总体积                 30 μl
10×Buffer              3 μl
dNTP(0.25 mM)          0.5 μl
Taq DNA polymerase      0.3 μl
27F(25μM)              1 μl
907R(25μM)             1 μl
BSA                    0.2 μl
模板DNA               1 μl
ddH2O                  13 μl
PCR程序
94℃预变性3min,94℃变性1min,54℃退火45s,72℃延伸90s,32个循环,72℃延伸10min。
PCR结果:

怎么有的扩增了有的没有扩增到啊,提取的时候都是有的。PCR体系和程序有什么问题吗?还有就是,PCR产物ED染色后跑胶检测,开始就拍到上图,过了一会连MARKER都很淡了,这又是为什么啊?谢谢了

[ Last edited by bear0329 on 2011-6-13 at 21:16 ]
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以马内利!
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bear0329

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lbzx at 2011-06-13 21:36:22:
1、DNTP 加到2ul
2、模板稀释20倍好了
3、用EB染色的吧,浓度加大

谢谢啊,程序问题不大吧?
以马内利!
3楼2011-06-13 21:42:05
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bear0329

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-06-13 23:59:53:
关于条带变淡的问题,那是因为看胶时时用紫外照射的,而紫外线会使DNA降解,故在紫外线照射下条带会逐渐变淡。下次操作最好快点噢。

谢谢斑竹啊
以马内利!
5楼2011-06-14 08:36:39
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bear0329

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by mirror3895 at 2011-06-14 09:50:34:
拍胶不就1、2分钟的事,有就有,没有就是没有,不会要很久吧,如果是你说的情况,得紫外灯一直开着,那对仪器也不好吧。可以试试改变退火温度的吧

谢谢提醒啊~我是新手,很多不懂的
以马内利!
12楼2011-06-14 19:22:59
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bear0329

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 彼岸花开V at 2011-06-14 17:04:17:

谢谢啦
以马内利!
13楼2011-06-14 19:23:21
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bear0329

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-06-14 22:36:17:
楼主说Maker变淡嘛,那可能就是紫外开太久了

PCR产物少,程序是要优化下的,呵呵

非常感谢啊
以马内利!
16楼2011-06-15 10:26:29
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bear0329

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-06-15 09:56:40:
dNTP(0.25 mM)          0.5 μl

dNTP浓度应该为2.5mM吧,然后加2 uL。

非常感谢啊
以马内利!
17楼2011-06-15 10:26:47
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