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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 以质粒为模板做pcr时要不要稀释? 已有4人参与

我新设计的引物在5端突变了几个碱基,以前的引物以质粒为模板扩增不出来,而以双酶切产物的话就能扩增出来,现在新设计的引物下游引物不变,上游引物突变了几个碱基,以质粒和双酶切产物为模版都扩增不出来呢,这是为什么?是不是以质粒为模板时一般要进行稀释,要比pcr双酶切产物浓度低才可以?
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
574759350: 金币+1 2014-01-10 13:51:07
以质粒为模板,PCR要求浓度在0.1-10ng 之间 就可以 了
2楼2014-01-10 09:56:21
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-10 11:19:32
574759350: 金币+1 2014-01-10 13:51:09
有时候懒得计算质粒浓度,一般是50ul体系里面加入0.1~0.5ul的质粒作为模板。这里说的质粒是提取出来正常的浓度,就是比marker最亮的条带都亮很多,亮到刺眼的那种。有时候也会稀释5~10倍后再加0.5~1ul
你的日子如何,你的力量也必如何!
3楼2014-01-10 10:09:23
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
574759350: 金币+1 2014-01-10 13:50:49
质粒需要稀释一下,我们一般都是稀释100-1000倍再做PCR
hehe
4楼2014-01-10 12:18:47
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cxwu10016869

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
574759350: 金币+2 2014-01-10 13:50:40
引物5‘端碱基突变后,不能与模板配对,退火温度应降低。
5楼2014-01-10 13:00:25
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heihei2866

铁虫 (正式写手)


gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2014-01-11 23:37:19
我们一般都稀释100倍左右再做模板
6楼2014-01-11 09:54:56
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