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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 以质粒为模板做pcr时要不要稀释？
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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 以质粒为模板做pcr时要不要稀释？ 已有4人参与

我新设计的引物在5端突变了几个碱基，以前的引物以质粒为模板扩增不出来，而以双酶切产物的话就能扩增出来，现在新设计的引物下游引物不变，上游引物突变了几个碱基，以质粒和双酶切产物为模版都扩增不出来呢，这是为什么？是不是以质粒为模板时一般要进行稀释，要比pcr双酶切产物浓度低才可以？
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1楼 2014-01-10 08:55:28
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cxwu10016869

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+2 2014-01-10 13:50:40
引物5‘端碱基突变后，不能与模板配对，退火温度应降低。
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5楼2014-01-10 13:00:25
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+1 2014-01-10 13:51:07
以质粒为模板，PCR要求浓度在0.1-10ng 之间 就可以 了
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2楼2014-01-10 09:56:21
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-10 11:19:32
574759350: 金币+1 2014-01-10 13:51:09
有时候懒得计算质粒浓度，一般是50ul体系里面加入0.1～0.5ul的质粒作为模板。这里说的质粒是提取出来正常的浓度，就是比marker最亮的条带都亮很多，亮到刺眼的那种。有时候也会稀释5～10倍后再加0.5～1ul
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你的日子如何，你的力量也必如何！
3楼2014-01-10 10:09:23
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+1 2014-01-10 13:50:49
质粒需要稀释一下，我们一般都是稀释100-1000倍再做PCR
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hehe
4楼2014-01-10 12:18:47
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