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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 长片段基因3.9K克隆不出来，求助
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生化与分子

新虫 (初入文坛)

[交流] 长片段基因3.9K克隆不出来，求助 已有34人参与

各位坛友好：
    我最近在构建一个重组载体，目的基因片段3.9K，已经克隆了近两周了，使用的是普通Taq酶，一直没有克隆出来，请有经验的坛友帮忙出出主意，谢谢啦！

[ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 08:53 ]
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panda73 hy_sandra

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1楼 2013-03-09 10:43:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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换个酶吧。虽然理论上普通taq可以P出来。再说，3.9kb的片段最好用高保真酶，否则出错了还要重新克隆。
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2楼2013-03-09 11:18:24
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panda73

金虫 (小有名气)
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推荐使用Takara的Primestar 高保真，高扩增效率，我们实验室一直用这个酶
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3楼2013-03-09 15:42:47
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)
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如果是要?慕M織弄出這麼大的片段，除了酵素要好之外，溶解組織的效率也要好，還有當初我把微量作出的片段?哪z中挖出，再PCR一次, 產量就很多了，可用?斫嬞|體

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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科研是無止盡的
4楼2013-03-09 16:06:52
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匿名

用户注销 (正式写手)
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5楼2013-03-09 18:49:44
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三撇五撇

银虫 (小有名气)
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普通Taq酶能扩出来 最近我都扩了好几条都是3k-5k的
用两步法：95度 3min20s
              98度 13s
              68度   4min
              72度   10min
     2-3循环23个循环   OK 搞定
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6楼2013-03-09 19:32:11
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)
★
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这么大片段，普通taq酶一般是扩不出来的，建议你还是换个酶用吧。
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
7楼2013-03-09 21:32:07
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匿名

用户注销 (著名写手)
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8楼2013-03-09 21:43:35
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554526385

铜虫 (小有名气)
★
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选用高保真酶。注意primerstart是P的平末端。
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我存在
9楼2013-03-09 22:56:10
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137167741

至尊木虫 (著名写手)
★
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第一、换高保真的酶
第二、检测模板质量，做几个内参
第三、考虑引物设计问题
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总有一天我要修改用户名。
10楼2013-03-10 10:36:47
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