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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-4Kb的基因P不出来
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昺昺

木虫 (小有名气)

[求助] 求助-4Kb的基因P不出来

有一个4Kb的基因，我需要把它P出来然后够载体，用cDNA二链为模板，混合酶、rTaq、LA Taq、pfu等酶都试过了，退火温度也做过梯度，还有，分成两段进行拼接的方法也用过，都是P不出来。请各位大虾指点一二，不甚感激！！

[ Last edited by 1949stone on 2012-10-23 at 07:50 ]
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太阳出来，星星要走。
1楼 2012-10-18 09:38:26
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果基因片段过大的话，建议分成几段P，然后拼接！
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-10-18 10:17:59
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hj890509

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+3, ★有帮助 2012-10-18 10:55:04
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-18 18:53:37
我们实验室也做一个基因大概4.7kb，刚开始P不出来，后来分成了四段分别P出来后拼接，现在已经做成功了，多试试
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3楼2012-10-18 10:45:26
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hj890509 at 2012-10-18 10:45:26
我们实验室也做一个基因大概4.7kb，刚开始P不出来，后来分成了四段分别P出来后拼接，现在已经做成功了，多试试

谢谢指点！那我分成三段也试过，还有，你在做拼接过程中，那些需要特别注意的，比如引物、PCR程序、扩增长度啊等等，我拼接的时候有两段都是1Kb左右，也是照样P不出来
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太阳出来，星星要走。
4楼2012-10-18 10:57:56
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吴劲松

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+3, ★有帮助 2012-10-18 12:17:46
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:53:49
模板是什么？有没有想办法优化模板质量？
       现在的TAQ酶扩增片段长度的能力有了很大提高，分段扩增显得没有必要。如果你的内参片段能扩增出来，应该尝试直接扩增4KB。分段扩增连来连去很麻烦，是不得以的选择。
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生命不息，奋斗不止
5楼2012-10-18 11:39:56
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hj890509

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
昺昺: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-18 15:23:25
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-18 18:54:02
采用的是重叠延伸PCR，有些片段是通过两轮PCR扩增，目的是为了增加重叠区域的长度，例如，　　扩增GH片段， 第一轮扩增所用条件和体系为　　　　　　模板（cDNA扩增后的片段）        1ul
GHu1         1ul
GHd1         1ul
10*buffer        5ul
dNTP         4ul
Taq plus    0.5ul
H2O              37.5ul
GH片段PCR扩增条件为: 94 ℃ 预变性 5min、94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸2min30s、72 ℃最后一轮 10min、进行30 循环 。（GH片段大约为2.5kb)
第二轮扩增条件和体系完全相同，除过模板用第一轮扩增出来的为模板，
　　我们刚开始时候也扩不出来经过分析进行调整模板浓度、比例以及PCR条件都摸索了好长时间，之后经过分析之后，问题可能是：①DG片段的浓度过低，于是，重新扩增DG片段，并用少量的TE回收，目的是为了提高DG的浓度。②PCR程序可能需要进行相应的调整。于是，根据实验的结果，对基因片段的浓度进行相应的调整，并对PCR的程序进行相应的改进。即实验——反馈、改进——再实验的过程。
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6楼2012-10-18 12:03:32
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 吴劲松 at 2012-10-18 11:39:56
模板是什么？有没有想办法优化模板质量？
       现在的TAQ酶扩增片段长度的能力有了很大提高，分段扩增显得没有必要。如果你的内参片段能扩增出来，应该尝试直接扩增4KB。分段扩增连来连去很麻烦，是不得以的选择 ...

谢谢！我原先用的是cDNA一链，没有P出来，考虑到是不是浓度不够，现在是用cDNA二链。我也试过拉其中的1Kb，也是没有成功，PCR程序、以及各种Taq酶也都试过了，没有作用，从基因组里面可以很容易P出片段，还请继续指点一二，十分感谢！
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太阳出来，星星要走。
7楼2012-10-18 12:22:01
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植物园园长

金虫 (小有名气)
天根最近出来一款快速的高保真酶Fast HiFi酶，扩增能力超强，建议试试。
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在路上～～Marketing!
8楼2012-10-18 16:15:57
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植物园园长

金虫 (小有名气)
人基因组和cDNA扩增到6kb都很亮，另外，延伸30sec/kb，保真度是pfu的8倍。
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在路上～～Marketing!
9楼2012-10-18 16:18:25
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 植物园园长 at 2012-10-18 16:18:25
人基因组和cDNA扩增到6kb都很亮，另外，延伸30sec/kb，保真度是pfu的8倍。

好的，多谢！我试一下。
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太阳出来，星星要走。
10楼2012-10-18 16:57:35
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