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昺昺

木虫 (小有名气)

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[求助] 求助-4Kb的基因P不出来

有一个4Kb的基因，我需要把它P出来然后够载体，用cDNA二链为模板，混合酶、rTaq、LA Taq、pfu等酶都试过了，退火温度也做过梯度，还有，分成两段进行拼接的方法也用过，都是P不出来。请各位大虾指点一二，不甚感激！！

[ Last edited by 1949stone on 2012-10-23 at 07:50 ]

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太阳出来，星星要走。

1楼 2012-10-18 09:38:26

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hj890509

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
昺昺: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-18 15:23:25
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-18 18:54:02

采用的是重叠延伸PCR，有些片段是通过两轮PCR扩增，目的是为了增加重叠区域的长度，例如，　　扩增GH片段，第一轮扩增所用条件和体系为　　　　　　模板（cDNA扩增后的片段） 1ul
GHu1 1ul
GHd1 1ul
10*buffer 5ul
dNTP 4ul
Taq plus 0.5ul
H2O 37.5ul
GH片段PCR扩增条件为: 94 ℃ 预变性 5min、94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸2min30s、72 ℃最后一轮 10min、进行30 循环。（GH片段大约为2.5kb)
第二轮扩增条件和体系完全相同，除过模板用第一轮扩增出来的为模板，
　　我们刚开始时候也扩不出来经过分析进行调整模板浓度、比例以及PCR条件都摸索了好长时间，之后经过分析之后，问题可能是：①DG片段的浓度过低，于是，重新扩增DG片段，并用少量的TE回收，目的是为了提高DG的浓度。②PCR程序可能需要进行相应的调整。于是，根据实验的结果，对基因片段的浓度进行相应的调整，并对PCR的程序进行相应的改进。即实验——反馈、改进——再实验的过程。