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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-4Kb的基因P不出来
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by wt3532 at 2012-10-19 13:42:17
是不是你的引物上是内含子的片段，所以P不出来

我的引物在开放阅读框的起始和结束位置
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太阳出来，星星要走。
21楼2012-10-19 14:47:22
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+1, ★有帮助 2012-10-20 09:17:53
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-22 13:33:18
最好使的高保真酶是东洋纺的，其次是TAKARA的。长片段用高保真酶来扩。东洋纺公司的酶最好。逆转录酶也是。你可以试试。同学用TAKARA的Primesatar扩的，也是4kb,先没扩出来，后延长了延伸时间，就OK了
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22楼2012-10-19 22:38:47
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
昺昺: 金币+2 2012-10-21 20:08:10
你是扩的基因的cDNA还是基因？同学扩的是基因的cDNA。相信你会成功的。
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23楼2012-10-19 22:40:46
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-19 22:40:46
你是扩的基因的cDNA还是基因？同学扩的是基因的cDNA。相信你会成功的。

我扩增的是cDNA，请指点一下
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太阳出来，星星要走。
24楼2012-10-20 09:15:15
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-19 22:38:47
最好使的高保真酶是东洋纺的，其次是TAKARA的。长片段用高保真酶来扩。东洋纺公司的酶最好。逆转录酶也是。你可以试试。同学用TAKARA的Primesatar扩的，也是4kb,先没扩出来，后延长了延伸时间，就OK了

你好！我也用过Primesatar，你扩增4Kb的时候，延伸时间是多少啊？
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太阳出来，星星要走。
25楼2012-10-20 09:17:39
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
昺昺: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-21 20:08:22
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-22 13:33:32
引用回帖:
17楼: Originally posted by 昺昺 at 2012-10-19 09:52:17
拉整个基因的话，设计的引物就很有限吧，退火温度我也做过64度，能具体指点一下吗？或者说把你的具体做法跟我说下，不甚感激！...

增加引物碱基数量（28bp左右），增加GC含量值。PCR程序里面退火温度间延长（50S左右），也不用高到64度。设置合适的GC含量值（65%左右），退火温度用58度左右应该没有太大问题。另外延伸时间按照你用的酶的延伸速度算出时间，再少个5-10s。
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26楼2012-10-20 14:10:18
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
昺昺: 金币+2, ★有帮助 2012-10-21 20:08:35
引用回帖:
25楼: Originally posted by 昺昺 at 2012-10-20 09:17:39
你好！我也用过Primesatar，你扩增4Kb的时候，延伸时间是多少啊？...

先分析一下基因结构，如果是高GC，加以用东洋纺的逆转录酶和高保真酶。至于延伸时间，普通酶是是4分钟，快酶的速度，我忘了，你找下说明书，在说明书的基础上增加一倍时间试试看
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27楼2012-10-20 19:18:34
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木左左

银虫 (正式写手)
同求啊，我的2000+的基因高GC（65%）一直扩不出来啊，用了很多酶，内参能扩出来，目的基因出不来，还有GDNA残留，用Dnase1消化过了.....郁闷
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28楼2012-10-20 20:24:39
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
昺昺: 金币+2 2012-10-21 20:08:42
引用回帖:
20楼: Originally posted by 昺昺 at 2012-10-19 14:45:37
是哪个公司的，什么型号的长片段扩增酶啊...

Fermentas的，我记得
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29楼2012-10-20 22:16:48
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木左左

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 昺昺 at 2012-10-18 12:22:01
谢谢！我原先用的是cDNA一链，没有P出来，考虑到是不是浓度不够，现在是用cDNA二链。我也试过拉其中的1Kb，也是没有成功，PCR程序、以及各种Taq酶也都试过了，没有作用，从基因组里面可以很容易P出片段，还请继续指 ...

麻烦问一下，这个cDNA第二链合成什么原理啊？有必要合成第二链吗？
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30楼2012-10-21 21:47:31
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