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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-4Kb的基因P不出来
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昺昺

木虫 (小有名气)

[求助] 求助-4Kb的基因P不出来

有一个4Kb的基因，我需要把它P出来然后够载体，用cDNA二链为模板，混合酶、rTaq、LA Taq、pfu等酶都试过了，退火温度也做过梯度，还有，分成两段进行拼接的方法也用过，都是P不出来。请各位大虾指点一二，不甚感激！！

[ Last edited by 1949stone on 2012-10-23 at 07:50 ]
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太阳出来，星星要走。
1楼 2012-10-18 09:38:26
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-19 09:50:11
个人认为4Kb的基因不算很大，可以直接通过PCR得到，建议提高引物特异性和GC含量值，然后通过提高退货温度得到。我做的最大的有近5Kb，效果都还不错。
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16楼2012-10-19 09:23:23
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
昺昺: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-21 20:08:22
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-22 13:33:32
引用回帖:
17楼: Originally posted by 昺昺 at 2012-10-19 09:52:17
拉整个基因的话，设计的引物就很有限吧，退火温度我也做过64度，能具体指点一下吗？或者说把你的具体做法跟我说下，不甚感激！...

增加引物碱基数量（28bp左右），增加GC含量值。PCR程序里面退火温度间延长（50S左右），也不用高到64度。设置合适的GC含量值（65%左右），退火温度用58度左右应该没有太大问题。另外延伸时间按照你用的酶的延伸速度算出时间，再少个5-10s。
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26楼2012-10-20 14:10:18
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