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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-4Kb的基因P不出来
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review

银虫 (著名写手)
会不会是引物问题？
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交流
11楼2012-10-18 17:03:58
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+3, ★有帮助 2012-10-19 08:55:44
现在酶的扩增能力应该问题不大，关键的是序列的保真性。如果扩不出，引物和模板应该是主要原因。
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好好学习，天天向上
12楼2012-10-18 22:52:41
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植物园园长

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+1, ★有帮助 2012-10-19 09:01:27
引用回帖:
10楼: Originally posted by 昺昺 at 2012-10-18 16:57:35
好的，多谢！我试一下。...

不客气，不过也要注意是否是引物的问题啊，这么多酶都扩增不出，引物有问题的可能性也很大。
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在路上～～Marketing!
13楼2012-10-19 08:47:37
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by dayulee at 2012-10-18 22:52:41
现在酶的扩增能力应该问题不大，关键的是序列的保真性。如果扩不出，引物和模板应该是主要原因。

谢谢！我也换过几对引物和模板，都没有扩增出目的条带，会扩增出比较小的条带，是不是保真度的问题？
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太阳出来，星星要走。
14楼2012-10-19 08:55:38
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 植物园园长 at 2012-10-19 08:47:37
不客气，不过也要注意是否是引物的问题啊，这么多酶都扩增不出，引物有问题的可能性也很大。...

我也曾试过从中间拉大约1Kb的片段，也是不行，而且我拉整个基因，设计引物也是有限的吧，这个4Kb的片段，我有时候会拉出2Kb的片段来，还请再指教一二。对了，你们用过天根那个高保真酶吗？拉过多大的片段？很容易吗？
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太阳出来，星星要走。
15楼2012-10-19 09:01:17
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-10-19 09:50:11
个人认为4Kb的基因不算很大，可以直接通过PCR得到，建议提高引物特异性和GC含量值，然后通过提高退货温度得到。我做的最大的有近5Kb，效果都还不错。
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16楼2012-10-19 09:23:23
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by reallpf at 2012-10-19 09:23:23
个人认为4Kb的基因不算很大，可以直接通过PCR得到，建议提高引物特异性和GC含量值，然后通过提高退货温度得到。我做的最大的有近5Kb，效果都还不错。

拉整个基因的话，设计的引物就很有限吧，退火温度我也做过64度，能具体指点一下吗？或者说把你的具体做法跟我说下，不甚感激！
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太阳出来，星星要走。
17楼2012-10-19 09:52:17
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wt3532

木虫 (著名写手)

涛声依旧

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是你的引物上是内含子的片段，所以P不出来
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18楼2012-10-19 13:42:17
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
长片段扩增酶可以胜任此任务的
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19楼2012-10-19 13:44:24
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by jl860822 at 2012-10-19 13:44:24
长片段扩增酶可以胜任此任务的

是哪个公司的，什么型号的长片段扩增酶啊
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太阳出来，星星要走。
20楼2012-10-19 14:45:37
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