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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-4Kb的基因P不出来
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昺昺

木虫 (小有名气)

[求助] 求助-4Kb的基因P不出来

有一个4Kb的基因，我需要把它P出来然后够载体，用cDNA二链为模板，混合酶、rTaq、LA Taq、pfu等酶都试过了，退火温度也做过梯度，还有，分成两段进行拼接的方法也用过，都是P不出来。请各位大虾指点一二，不甚感激！！

[ Last edited by 1949stone on 2012-10-23 at 07:50 ]
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太阳出来，星星要走。
1楼 2012-10-18 09:38:26
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 植物园园长 at 2012-10-19 08:47:37
不客气，不过也要注意是否是引物的问题啊，这么多酶都扩增不出，引物有问题的可能性也很大。...

我也曾试过从中间拉大约1Kb的片段，也是不行，而且我拉整个基因，设计引物也是有限的吧，这个4Kb的片段，我有时候会拉出2Kb的片段来，还请再指教一二。对了，你们用过天根那个高保真酶吗？拉过多大的片段？很容易吗？
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太阳出来，星星要走。
15楼2012-10-19 09:01:17
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果基因片段过大的话，建议分成几段P，然后拼接！
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-10-18 10:17:59
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hj890509

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+3, ★有帮助 2012-10-18 10:55:04
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-18 18:53:37
我们实验室也做一个基因大概4.7kb，刚开始P不出来，后来分成了四段分别P出来后拼接，现在已经做成功了，多试试
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3楼2012-10-18 10:45:26
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hj890509 at 2012-10-18 10:45:26
我们实验室也做一个基因大概4.7kb，刚开始P不出来，后来分成了四段分别P出来后拼接，现在已经做成功了，多试试

谢谢指点！那我分成三段也试过，还有，你在做拼接过程中，那些需要特别注意的，比如引物、PCR程序、扩增长度啊等等，我拼接的时候有两段都是1Kb左右，也是照样P不出来
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太阳出来，星星要走。
4楼2012-10-18 10:57:56
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