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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-4Kb的基因P不出来
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昺昺

木虫 (小有名气)

[求助] 求助-4Kb的基因P不出来

有一个4Kb的基因，我需要把它P出来然后够载体，用cDNA二链为模板，混合酶、rTaq、LA Taq、pfu等酶都试过了，退火温度也做过梯度，还有，分成两段进行拼接的方法也用过，都是P不出来。请各位大虾指点一二，不甚感激！！

[ Last edited by 1949stone on 2012-10-23 at 07:50 ]
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太阳出来，星星要走。
1楼 2012-10-18 09:38:26
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昺昺

木虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by hj890509 at 2012-10-18 10:45:26
我们实验室也做一个基因大概4.7kb，刚开始P不出来，后来分成了四段分别P出来后拼接，现在已经做成功了，多试试

谢谢指点！那我分成三段也试过，还有，你在做拼接过程中，那些需要特别注意的，比如引物、PCR程序、扩增长度啊等等，我拼接的时候有两段都是1Kb左右，也是照样P不出来
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太阳出来，星星要走。
4楼2012-10-18 10:57:56
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昺昺

木虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by 吴劲松 at 2012-10-18 11:39:56
模板是什么？有没有想办法优化模板质量？
       现在的TAQ酶扩增片段长度的能力有了很大提高，分段扩增显得没有必要。如果你的内参片段能扩增出来，应该尝试直接扩增4KB。分段扩增连来连去很麻烦，是不得以的选择 ...

谢谢！我原先用的是cDNA一链，没有P出来，考虑到是不是浓度不够，现在是用cDNA二链。我也试过拉其中的1Kb，也是没有成功，PCR程序、以及各种Taq酶也都试过了，没有作用，从基因组里面可以很容易P出片段，还请继续指点一二，十分感谢！
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太阳出来，星星要走。
7楼2012-10-18 12:22:01
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木虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by 植物园园长 at 2012-10-18 16:18:25
人基因组和cDNA扩增到6kb都很亮，另外，延伸30sec/kb，保真度是pfu的8倍。

好的，多谢！我试一下。
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太阳出来，星星要走。
10楼2012-10-18 16:57:35
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木虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by dayulee at 2012-10-18 22:52:41
现在酶的扩增能力应该问题不大，关键的是序列的保真性。如果扩不出，引物和模板应该是主要原因。

谢谢！我也换过几对引物和模板，都没有扩增出目的条带，会扩增出比较小的条带，是不是保真度的问题？
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14楼2012-10-19 08:55:38
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木虫 (小有名气)
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13楼: Originally posted by 植物园园长 at 2012-10-19 08:47:37
不客气，不过也要注意是否是引物的问题啊，这么多酶都扩增不出，引物有问题的可能性也很大。...

我也曾试过从中间拉大约1Kb的片段，也是不行，而且我拉整个基因，设计引物也是有限的吧，这个4Kb的片段，我有时候会拉出2Kb的片段来，还请再指教一二。对了，你们用过天根那个高保真酶吗？拉过多大的片段？很容易吗？
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太阳出来，星星要走。
15楼2012-10-19 09:01:17
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木虫 (小有名气)
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16楼: Originally posted by reallpf at 2012-10-19 09:23:23
个人认为4Kb的基因不算很大，可以直接通过PCR得到，建议提高引物特异性和GC含量值，然后通过提高退货温度得到。我做的最大的有近5Kb，效果都还不错。

拉整个基因的话，设计的引物就很有限吧，退火温度我也做过64度，能具体指点一下吗？或者说把你的具体做法跟我说下，不甚感激！
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太阳出来，星星要走。
17楼2012-10-19 09:52:17
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木虫 (小有名气)
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19楼: Originally posted by jl860822 at 2012-10-19 13:44:24
长片段扩增酶可以胜任此任务的

是哪个公司的，什么型号的长片段扩增酶啊
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太阳出来，星星要走。
20楼2012-10-19 14:45:37
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昺昺

木虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by wt3532 at 2012-10-19 13:42:17
是不是你的引物上是内含子的片段，所以P不出来

我的引物在开放阅读框的起始和结束位置
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太阳出来，星星要走。
21楼2012-10-19 14:47:22
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昺昺

木虫 (小有名气)
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23楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-10-19 22:40:46
你是扩的基因的cDNA还是基因？同学扩的是基因的cDNA。相信你会成功的。

我扩增的是cDNA，请指点一下
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太阳出来，星星要走。
24楼2012-10-20 09:15:15
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