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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-4Kb的基因P不出来
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昺昺

木虫 (小有名气)

[求助] 求助-4Kb的基因P不出来

有一个4Kb的基因，我需要把它P出来然后够载体，用cDNA二链为模板，混合酶、rTaq、LA Taq、pfu等酶都试过了，退火温度也做过梯度，还有，分成两段进行拼接的方法也用过，都是P不出来。请各位大虾指点一二，不甚感激！！

[ Last edited by 1949stone on 2012-10-23 at 07:50 ]
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太阳出来，星星要走。
1楼 2012-10-18 09:38:26
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木左左

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 昺昺 at 2012-10-18 12:22:01
谢谢！我原先用的是cDNA一链，没有P出来，考虑到是不是浓度不够，现在是用cDNA二链。我也试过拉其中的1Kb，也是没有成功，PCR程序、以及各种Taq酶也都试过了，没有作用，从基因组里面可以很容易P出片段，还请继续指 ...

麻烦问一下，这个cDNA第二链合成什么原理啊？有必要合成第二链吗？
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30楼2012-10-21 21:47:31
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果基因片段过大的话，建议分成几段P，然后拼接！
赞一下 回复此楼
持之以恒、永不放弃！
2楼2012-10-18 10:17:59
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hj890509

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
昺昺: 金币+3, ★有帮助 2012-10-18 10:55:04
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-18 18:53:37
我们实验室也做一个基因大概4.7kb，刚开始P不出来，后来分成了四段分别P出来后拼接，现在已经做成功了，多试试
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3楼2012-10-18 10:45:26
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昺昺

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hj890509 at 2012-10-18 10:45:26
我们实验室也做一个基因大概4.7kb，刚开始P不出来，后来分成了四段分别P出来后拼接，现在已经做成功了，多试试

谢谢指点！那我分成三段也试过，还有，你在做拼接过程中，那些需要特别注意的，比如引物、PCR程序、扩增长度啊等等，我拼接的时候有两段都是1Kb左右，也是照样P不出来
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太阳出来，星星要走。
4楼2012-10-18 10:57:56
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