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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-4Kb的基因P不出来
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昺昺

木虫 (小有名气)

[求助] 求助-4Kb的基因P不出来

有一个4Kb的基因，我需要把它P出来然后够载体，用cDNA二链为模板，混合酶、rTaq、LA Taq、pfu等酶都试过了，退火温度也做过梯度，还有，分成两段进行拼接的方法也用过，都是P不出来。请各位大虾指点一二，不甚感激！！

[ Last edited by 1949stone on 2012-10-23 at 07:50 ]
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太阳出来，星星要走。
1楼 2012-10-18 09:38:26
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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昺昺: 金币+1, ★有帮助 2012-10-20 09:17:53
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-22 13:33:18
最好使的高保真酶是东洋纺的，其次是TAKARA的。长片段用高保真酶来扩。东洋纺公司的酶最好。逆转录酶也是。你可以试试。同学用TAKARA的Primesatar扩的，也是4kb,先没扩出来，后延长了延伸时间，就OK了
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22楼2012-10-19 22:38:47
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
昺昺: 金币+2 2012-10-21 20:08:10
你是扩的基因的cDNA还是基因？同学扩的是基因的cDNA。相信你会成功的。
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23楼2012-10-19 22:40:46
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tulip1213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
昺昺: 金币+2, ★有帮助 2012-10-21 20:08:35
引用回帖:
25楼: Originally posted by 昺昺 at 2012-10-20 09:17:39
你好！我也用过Primesatar，你扩增4Kb的时候，延伸时间是多少啊？...

先分析一下基因结构，如果是高GC，加以用东洋纺的逆转录酶和高保真酶。至于延伸时间，普通酶是是4分钟，快酶的速度，我忘了，你找下说明书，在说明书的基础上增加一倍时间试试看
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27楼2012-10-20 19:18:34
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