长片段基因3.9K克隆不出来，求助 - 分子生物 - PCR相关 - 第3页小木虫论坛-学术科研互动平台

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baihaer

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6楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2013-03-09 19:32:11
普通Taq酶能扩出来最近我都扩了好几条都是3k-5k的
用两步法：95度 3min20s
            98度 13s
            68度 4min
            72度 10min
   2-3循环23个循环 OK 搞定

哥们，我觉得您的68度有点高哈，一般退火温度应该是根据你的引物长度和GC比来推算的，一般公司合成的引物都会附有建议的退火温度。而且72度延伸温度，时间一般不用那么久，一般是1k/1min所以3.9k最多4.5min就可以，PCR时间太长容易造成产物的突变。

没有SB的事，只有SB的人

21楼2014-02-07 22:10:58

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780715510

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楼主好，我们上海捷瑞生物工程有限公司专业合成基因片段。可以让我们帮你合成

22楼2014-02-08 13:17:48

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三撇五撇

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21楼: Originally posted by baihaer at 2014-02-07 22:10:58
哥们，我觉得您的68度有点高哈，一般退火温度应该是根据你的引物长度和GC比来推算的，一般公司合成的引物都会附有建议的退火温度。而且72度延伸温度，时间一般不用那么久，一般是1k/1min所以3.9k最多4.5min就可以， ...

仅仅经验之谈，一般都能搞定

23楼2014-02-08 22:29:53

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三撇五撇

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22楼: Originally posted by 780715510 at 2014-02-08 13:17:48
楼主好，我们上海捷瑞生物工程有限公司专业合成基因片段。可以让我们帮你合成

价格如何？

24楼2014-02-08 22:30:21

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b6122

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延长延伸时间试试。还有确定引物没有问题。

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25楼2014-02-09 01:00:23

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lhs521521

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这么长的片段还是要高保真酶给力，我用primerstar P过2K多的，测序正确，如果片段里GC含量高，那就更得注意了！

寻找真正的自我！

26楼2014-02-09 10:23:51

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393658000

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请问您是什么物种，什么模板？没准我能帮到您！

27楼2014-02-10 10:42:42

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三蛰

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其实有时候普通的taq酶最好用，反而一些高保真的taq酶不利于扩增。真的实验室里很多师兄师姐都这样说过。

我不会！

28楼2014-02-12 15:53:05

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fangchen8678

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这个还是选用高保真酶吧，普通taq酶适用条件宽但是扩长片段就有点吃力。还有并不是说高保真酶扩不好，恰恰是因为保真性高所以对体系要求严格罢了。

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29楼2014-02-12 21:05:24

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玲珑琉璃

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引用回帖:

6楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2013-03-09 19:32:11
普通Taq酶能扩出来最近我都扩了好几条都是3k-5k的
用两步法：95度 3min20s
            98度 13s
            68度 4min
            72度 10min
   2-3循环23个循环 OK 搞定

就是退火温度和延伸温度是一样的吗？
一般情况下退火温度都是68度吗，还是因酶而异呢？

一个不成熟男人的标志是他愿意为某种事业英勇地死去，一个成熟男人的标志是他愿意为某种事业卑贱地活着。━━━塞林格

30楼2014-02-13 14:23:36

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