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baihaer

铜虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2013-03-09 19:32:11
普通Taq酶能扩出来 最近我都扩了好几条都是3k-5k的
用两步法:95度 3min20s
              98度 13s
              68度   4min
              72度   10min
     2-3循环23个循环   OK 搞定

哥们,我觉得您的68度有点高哈,一般退火温度应该是根据你的引物长度和GC比来推算的,一般公司合成的引物都会附有建议的退火温度。而且72度延伸温度,时间一般不用那么久,一般是1k/1min所以3.9k最多4.5min就可以,PCR时间太长容易造成产物的突变。
没有SB的事,只有SB的人
21楼2014-02-07 22:10:58
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780715510

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
楼主好,我们上海捷瑞生物工程有限公司 专业合成基因片段。可以让我们帮你合成
22楼2014-02-08 13:17:48
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三撇五撇

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
21楼: Originally posted by baihaer at 2014-02-07 22:10:58
哥们,我觉得您的68度有点高哈,一般退火温度应该是根据你的引物长度和GC比来推算的,一般公司合成的引物都会附有建议的退火温度。而且72度延伸温度,时间一般不用那么久,一般是1k/1min所以3.9k最多4.5min就可以, ...

仅仅经验之谈,一般都能搞定
23楼2014-02-08 22:29:53
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三撇五撇

银虫 (小有名气)

引用回帖:
22楼: Originally posted by 780715510 at 2014-02-08 13:17:48
楼主好,我们上海捷瑞生物工程有限公司 专业合成基因片段。可以让我们帮你合成

价格如何?
24楼2014-02-08 22:30:21
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b6122

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
延长延伸时间试试。还有确定引物没有问题。

[ 发自小木虫客户端 ]
25楼2014-02-09 01:00:23
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lhs521521

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这么长的片段还是要高保真酶给力,我用primerstar P过2K多的,测序正确,如果片段里GC含量高,那就更得注意了!
寻找真正的自我!
26楼2014-02-09 10:23:51
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393658000

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
请问您是什么物种,什么模板?没准我能帮到您!
27楼2014-02-10 10:42:42
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三蛰

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
其实有时候普通的taq酶最好用,反而一些高保真的taq酶不利于扩增。真的实验室里很多师兄师姐都这样说过。
我不会!
28楼2014-02-12 15:53:05
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fangchen8678

铁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这个还是选用高保真酶吧,普通taq酶适用条件宽但是扩长片段就有点吃力。还有并不是说高保真酶扩不好,恰恰是因为保真性高所以对体系要求严格罢了。

[ 发自小木虫客户端 ]
29楼2014-02-12 21:05:24
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玲珑琉璃

铜虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2013-03-09 19:32:11
普通Taq酶能扩出来 最近我都扩了好几条都是3k-5k的
用两步法:95度 3min20s
              98度 13s
              68度   4min
              72度   10min
     2-3循环23个循环   OK 搞定

就是退火温度和延伸温度是一样的吗?
一般情况下退火温度都是68度吗,还是因酶而异呢?
一个不成熟男人的标志是他愿意为某种事业英勇地死去,一个成熟男人的标志是他愿意为某种事业卑贱地活着。━━━塞林格
30楼2014-02-13 14:23:36
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