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scienzyme

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这么长的片段要用高保真的聚合酶才行,而且效率要高,推荐NEB的Phusion DNA polymerase或者国产的全式金FastPfu。
克隆的时候可以考虑Circular polymerase extension cloning,完全不用限制酶和连接酶的操作步骤。
http://www.plosone.org/article/i ... ournal.pone.0006441
http://www.nature.com/nprot/journal/v6/n2/abs/nprot.2010.181.html
11楼2013-03-10 12:16:24
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熊大斌

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
换一个酶试试,普通Taq在扩大片段时,活性可能的不会保持到底,有LA Taq试试,大片段我们都扩过,效果还不错。
12楼2013-03-10 15:00:03
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chenchenky

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我经常克隆长片段,可以加我QQ讨论1922008223
13楼2013-03-10 19:30:36
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小菜一碟。我7k的都克隆过,一点问题没有
14楼2013-03-10 21:43:09
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
3.9kb还是比较容易的,我经常克隆5-8kb的没有问题啊.
15楼2013-03-10 22:52:37
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
15楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-03-10 22:52:37
3.9kb还是比较容易的,我经常克隆5-8kb的没有问题啊.

都不突变吗?话说我几个月就得到1个目的基因
16楼2013-03-11 22:33:39
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
14楼: Originally posted by biosci at 2013-03-10 21:43:09
小菜一碟。我7k的都克隆过,一点问题没有

都不突变吗?话说我几个月就得到1个目的基因
17楼2013-03-11 22:34:02
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夏尔list

金虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
高保真只是确定保证性的
可以用LA taq或者你在网上找找其他扩增长片段的酶
做实验还是要自己试一下
两个星期扩不出来很正常
18楼2013-03-11 22:54:19
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)

太省钱了
19楼2013-03-12 00:34:03
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
建议使用长片段PCR相关的产品,长片段PCR中使用的酶一般都是混合酶,其保真性要比普通Taq酶高,扩增出来的片段末端是加A的,可直接用于T-A克隆,上海生工最近刚出来的长片段PCR扩增产品,我已经使用过了,效果不错,我扩增的是5kb,扩增效果很好,测序保真性也很好。
rainwater
20楼2014-02-06 14:33:26
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