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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因克隆转化表达遇到问题，求大神解答
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本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看

echochen1017

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因克隆转化表达遇到问题，求大神解答

最近在做基因克隆转化的实验，目的基因与pET28B质粒用T4连接酶连接过夜，后转入感受态BL21(DE3)中，涂平板（抗性筛选），反复3次，均未有菌落出现，求分析原因！急求！！谢帮助！！
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1楼2013-04-09 14:28:12
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回帖置顶 ( 共有2个 )

守好我的道

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢分析 2013-04-10 07:11:05
echochen1017: 金币+1 2013-04-27 21:28:17
silicare: BioEPI+1 2013-04-28 09:56:58
做个实验对照。个人认为可以这样设计：首先用你所用的pET28B，直接转化，涂板。长斑正常，说明你用的平板，感受态细胞和转化的操作没有问题。其次再验证你的酶切和连接有没有问题。一个一个的验证，实验做不出来，总是有原因的。
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2楼2013-04-10 02:03:11
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香水橙子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
echochen1017: 金币+1, ★有帮助 2013-04-27 21:25:22
silicare: BioEPI+1, 鼓励新虫发帖交流 2013-04-28 09:57:51
你应该一步一步的做空白实验排查，用别的连接产物接种平板（同抗性）以检测是否是平板问题，空质粒转化涂板以验证感受态是否正常，酶切我还没遇见过棘手的问题，但是连接遇见过，换过好几种方法，T4，快速连接试剂盒，温度的话，16°C过夜，25°C15min什么的都尝试过。不过你说什么都不长，可能还是感受态有问题，转化没成功。
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俄罗斯方块告诉我们：犯下的错误会累积，获得的成功会消失。
7楼2013-04-15 22:40:27
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普通回帖

carlisle612

新虫 (初入文坛)
★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-04-12 05:50:34
会不会是感受态的问题~没有一个菌落出现嘛？建议先换个感受态试一下   28a是卡那抗性噢，上次我粗心大意加了氨苄~注意小细节~楼主加油噢！
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天下乌鸦一般黑
3楼2013-04-10 11:39:08
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haoziying

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
wizardfan: 金币+2, 说得有道理 2013-04-12 05:51:06
楼主说的不是很详细。
比如连接连接片段的大小等等，当然2楼说的比较详细。自己设计对照试验一一排除。
你做了三次没连上，我曾经一个多月一个也没有连上。但是经过这一个月的练习，后来基本上每次都能连上。
还是要多做，才能熟能生巧。
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4楼2013-04-10 18:10:53
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daodoudou

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-04-12 05:51:18
一般是感受态的问题
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5楼2013-04-11 16:30:05
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jiachd2010

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-04-12 05:54:34
首先你得方案没有错误，每一步的试剂、材料及加量等都正确，然后没做一步都跑一下电泳，作对照，最后看哪一步有问题就再找原因
酶切质粒的时候有没有把抗性基因给破坏，引物的设计是否准确等都要验证啊
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修身齐家治国平天下
6楼2013-04-11 23:06:25
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by carlisle612 at 2013-04-10 11:39:08
会不会是感受态的问题~没有一个菌落出现嘛？建议先换个感受态试一下   28a是卡那抗性噢，上次我粗心大意加了氨苄~注意小细节~楼主加油噢！

谢谢~~~，抗性都没错，感受态也验证了同一批出来的，转别的质粒都转进去了，我怀疑是连接没连好~~
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8楼2013-04-27 11:13:47
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jiachd2010 at 2013-04-11 23:06:25
首先你得方案没有错误，每一步的试剂、材料及加量等都正确，然后没做一步都跑一下电泳，作对照，最后看哪一步有问题就再找原因
酶切质粒的时候有没有把抗性基因给破坏，引物的设计是否准确等都要验证啊

谢谢~~突变已经成功，并测序没问题，就想连到表达载体上表达
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9楼2013-04-27 11:14:24
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qdwmq

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
echochen1017: 金币+1 2013-04-27 21:26:28
需要空质粒对照，另外如果表达的蛋白对大肠杆菌有毒性，也会不长菌。
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10楼2013-04-27 15:02:01
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