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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 已知基因序列，要用PCR克隆该基因，模板从哪里来？
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矛盾聚合体

铜虫 (初入文坛)

[求助] 已知基因序列，要用PCR克隆该基因，模板从哪里来？

　假设我已经得到基因序列了，我也知道下一步要PCR，设计引物什么的，但是我就是不知道模板从哪里来（我手上没有现成的）。。。是直接捣碎一个人的细胞提取全DNA吗？这样的话，模板未免也太多太杂了吧，得浪费多少核苷酸啊。。。
　我的想法是，把DNA提取出来以后用限制酶切了，然后电泳，比如目的基因是500bp的，那我就选500bp的区段电泳出来的DNA片段作PCR。。。可是，即便是这样，也还是含有很多很多的片段啊，而且限制酶切出来的位点正好在我要的基因上怎末办？小弟只是处在理论阶段的大一生，从来没有动手操作过，提取的想法未免幼稚，请各位见谅
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1楼 2013-01-06 10:45:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhang881007

金虫 (小有名气)
晕！还可以   全合成
纠正一下你的想法， 第一PCR可以从全基因中放大你需要的基因，而不需要对样品处理，处理了反而会糟。第二PCR事实上用的核苷酸量是很少的，微克左右，不必担心浪费。第三，如果你需要较多的目标基因，一般都将他放入质粒，在细菌中扩增，再提取。
通常情况下，基因工程单次的实验费用都不高！
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shine
7楼2013-01-06 14:25:53
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普通回帖

weiwei_l

木虫 (职业作家)

有理想的人
加油楼主
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有志青年
2楼2013-01-06 10:58:40
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justdilo

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-06 19:46:09
酶切不是更浪费，切下来的核苷酸不是一样被扔掉了，何况还要用内切酶。
DNA做模板嘛，要考虑有没有内含子，可以先试一试，建议用RNA。
不过别灰心，作为大一生，你已经很强大很强大了。
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我，一无所有！
3楼2013-01-06 10:59:05
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矛盾聚合体

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by weiwei_l at 2013-01-06 10:58:40
加油楼主

谢谢~~
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4楼2013-01-06 11:02:10
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矛盾聚合体

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by justdilo at 2013-01-06 10:59:05
酶切不是更浪费，切下来的核苷酸不是一样被扔掉了，何况还要用内切酶。
DNA做模板嘛，要考虑有没有内含子，可以先试一试，建议用RNA。
不过别灰心，作为大一生，你已经很强大很强大了。

谢谢。。。其实我想知道大家都是怎么做的
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5楼2013-01-06 11:03:52
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tigertang

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
矛盾聚合体: 金币+15, ★★★★★最佳答案, 谢谢了。。。意思就是说，这种技术其实还不是很成熟很普遍对吗？ 2013-01-06 11:27:01
1. 最省事的办法：查文献，向其他研究者要带该基因的质粒，直接用作模板或你自己的研究
2.从公司买带cDNA的载体
3.自己提取RNA，反转录成cDNA,以cDNA为模板，扩增你想要的基因（一定要事先确认拟用于提取RNA的组织或细胞里，该基因表达比较高）
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6楼2013-01-06 11:15:38
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
既然能设计出引物，说明这个基因上下游都是很保守的序列了，不用担心其他片段的影响。
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Thank-you，so-blue.
8楼2013-01-06 15:15:55
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tigertang

木虫 (著名写手)
"意思就是说，这种技术其实还不是很成熟很普遍对吗?"

这个说法不妥，已经是常规技术了。
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9楼2013-01-06 17:27:05
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看天

木虫 (知名作家)
提基因组 不需要酶切 直接用引物PCR PCR特异性很好 智慧P出引物之间的特定序列 我不明白你想什么
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
10楼2013-01-06 19:26:23
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