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矛盾聚合体

铜虫 (初入文坛)

[求助] 已知基因序列,要用PCR克隆该基因,模板从哪里来?

 假设我已经得到基因序列了,我也知道下一步要PCR,设计引物什么的,但是我就是不知道模板从哪里来(我手上没有现成的)。。。是直接捣碎一个人的细胞提取全DNA吗?这样的话,模板未免也太多太杂了吧,得浪费多少核苷酸啊。。。
 我的想法是,把DNA提取出来以后用限制酶切了,然后电泳,比如目的基因是500bp的,那我就选500bp的区段电泳出来的DNA片段作PCR。。。可是,即便是这样,也还是含有很多很多的片段啊,而且限制酶切出来的位点正好在我要的基因上怎末办?小弟只是处在理论阶段的大一生,从来没有动手操作过,提取的想法未免幼稚,请各位见谅
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矛盾聚合体

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by weiwei_l at 2013-01-06 10:58:40
加油楼主

谢谢~~
4楼2013-01-06 11:02:10
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justdilo

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-06 19:46:09
酶切不是更浪费,切下来的核苷酸不是一样被扔掉了,何况还要用内切酶。
DNA做模板嘛,要考虑有没有内含子,可以先试一试,建议用RNA。
不过别灰心,作为大一生,你已经很强大很强大了。
我,一无所有!
3楼2013-01-06 10:59:05
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矛盾聚合体

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by justdilo at 2013-01-06 10:59:05
酶切不是更浪费,切下来的核苷酸不是一样被扔掉了,何况还要用内切酶。
DNA做模板嘛,要考虑有没有内含子,可以先试一试,建议用RNA。
不过别灰心,作为大一生,你已经很强大很强大了。

谢谢。。。其实我想知道大家都是怎么做的
5楼2013-01-06 11:03:52
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tigertang

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
矛盾聚合体: 金币+15, ★★★★★最佳答案, 谢谢了。。。意思就是说,这种技术其实还不是很成熟很普遍对吗? 2013-01-06 11:27:01
1. 最省事的办法:查文献,向其他研究者要带该基因的质粒,直接用作模板或你自己的研究
2.从公司买带cDNA的载体
3.自己提取RNA,反转录成cDNA,以cDNA为模板,扩增你想要的基因(一定要事先确认拟用于提取RNA的组织或细胞里,该基因表达比较高)
6楼2013-01-06 11:15:38
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