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矛盾聚合体

铜虫 (初入文坛)

[求助] 已知基因序列,要用PCR克隆该基因,模板从哪里来?

 假设我已经得到基因序列了,我也知道下一步要PCR,设计引物什么的,但是我就是不知道模板从哪里来(我手上没有现成的)。。。是直接捣碎一个人的细胞提取全DNA吗?这样的话,模板未免也太多太杂了吧,得浪费多少核苷酸啊。。。
 我的想法是,把DNA提取出来以后用限制酶切了,然后电泳,比如目的基因是500bp的,那我就选500bp的区段电泳出来的DNA片段作PCR。。。可是,即便是这样,也还是含有很多很多的片段啊,而且限制酶切出来的位点正好在我要的基因上怎末办?小弟只是处在理论阶段的大一生,从来没有动手操作过,提取的想法未免幼稚,请各位见谅
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zhang881007

金虫 (小有名气)

晕!还可以   全合成
纠正一下你的想法, 第一PCR可以从全基因中放大你需要的基因,而不需要对样品处理,处理了反而会糟。第二PCR事实上用的核苷酸量是很少的,微克左右,不必担心浪费。第三,如果你需要较多的目标基因,一般都将他放入质粒,在细菌中扩增,再提取。
通常情况下,基因工程单次的实验费用都不高!
shine
7楼2013-01-06 14:25:53
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普通回帖

weiwei_l

木虫 (职业作家)

有理想的人

有志青年
2楼2013-01-06 10:58:40
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justdilo

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-06 19:46:09
酶切不是更浪费,切下来的核苷酸不是一样被扔掉了,何况还要用内切酶。
DNA做模板嘛,要考虑有没有内含子,可以先试一试,建议用RNA。
不过别灰心,作为大一生,你已经很强大很强大了。
我,一无所有!
3楼2013-01-06 10:59:05
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矛盾聚合体

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by weiwei_l at 2013-01-06 10:58:40
加油楼主

谢谢~~
4楼2013-01-06 11:02:10
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矛盾聚合体

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by justdilo at 2013-01-06 10:59:05
酶切不是更浪费,切下来的核苷酸不是一样被扔掉了,何况还要用内切酶。
DNA做模板嘛,要考虑有没有内含子,可以先试一试,建议用RNA。
不过别灰心,作为大一生,你已经很强大很强大了。

谢谢。。。其实我想知道大家都是怎么做的
5楼2013-01-06 11:03:52
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tigertang

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
矛盾聚合体: 金币+15, ★★★★★最佳答案, 谢谢了。。。意思就是说,这种技术其实还不是很成熟很普遍对吗? 2013-01-06 11:27:01
1. 最省事的办法:查文献,向其他研究者要带该基因的质粒,直接用作模板或你自己的研究
2.从公司买带cDNA的载体
3.自己提取RNA,反转录成cDNA,以cDNA为模板,扩增你想要的基因(一定要事先确认拟用于提取RNA的组织或细胞里,该基因表达比较高)
6楼2013-01-06 11:15:38
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

既然能设计出引物,说明这个基因上下游都是很保守的序列了,不用担心其他片段的影响。
Thank-you,so-blue.
8楼2013-01-06 15:15:55
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tigertang

木虫 (著名写手)

"意思就是说,这种技术其实还不是很成熟很普遍对吗?"

这个说法不妥,已经是常规技术了。
9楼2013-01-06 17:27:05
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看天

木虫 (知名作家)

提基因组 不需要酶切 直接用引物PCR PCR特异性很好 智慧P出引物之间的特定序列 我不明白你想什么
戒嗔怒以养肝气,省言语以养神气,多读书以养质气,顺时令以养元气,不拘节以养大气,观天变以养灵气,莫强求规于运气。
10楼2013-01-06 19:26:23
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