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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 求帮助！基因连接克隆载体后转化大肠杆菌，两天了都没长出菌。。。
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Z深白色J

新虫 (初入文坛)

[求助] 求帮助！基因连接克隆载体后转化大肠杆菌，两天了都没长出菌。。。 已有6人参与

我的目的基因片段回收后与克隆载体连接，转化大肠杆菌涂板后长了两天都没长出菌，是感受态不好吗？请各位大神帮我找找原因，分析一下问题出在哪里，谢谢！
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1楼 2014-06-14 16:10:56
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

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gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-06-16 12:34:12
转化不长菌的原因很多。1感受态细胞不行，这个一般都是同时转化一个已知的质粒，如果质粒长了，就可以排除。2转化过程发生错误，同样用质粒做对照。3抗生素加错了或者抗生素浓度过高。4连接不成功。转化时连接产物的浓度最起码要十几纳克，如果只有几纳克，转化效率再低点，就不长菌了。另外如果是平末端连接的话，效率更低。
做转化要加对照的，一个阳性一个阴性。你这样不加对照去做，很难找到失败的原因。
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4楼2014-06-15 14:53:14
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ltfe567

木虫 (正式写手)

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-06-14 21:33:10
我的也是，后来室温放置了几天慢慢才有，咨询技术支持说是让检查下感受态细胞，估计是感受态的问题
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2楼2014-06-14 16:24:32
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miao1992

新虫 (初入文坛)
没有连上去啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-06-14 19:34:55
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Z深白色J

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2014-06-15 14:53:14
转化不长菌的原因很多。1感受态细胞不行，这个一般都是同时转化一个已知的质粒，如果质粒长了，就可以排除。2转化过程发生错误，同样用质粒做对照。3抗生素加错了或者抗生素浓度过高。4连接不成功。转化时连接产物的 ...

转化一个已知的质粒是什么意思？
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5楼2014-06-16 11:49:13
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by Z深白色J at 2014-06-16 11:49:13
转化一个已知的质粒是什么意思？...

比如说买来的质粒，或者别人已经构建好的质粒，不是那种需要你自己连接的质粒。
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6楼2014-06-16 13:32:15
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

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Z深白色J(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-19 09:16:51
会不会胶回收试剂盒有问题啊？我觉得用质量不好的胶回收试剂盒切胶回收也会连不上的，用control insert试试连连看。
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7楼2014-06-16 22:13:31
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dongge2013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

没长出菌，就先别转化，只用感受态细胞培养下看看
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8楼2014-06-18 08:20:11
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
Z深白色J(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-19 09:17:06
哎，平时多做对照就能找到原因了，转化无非就是平板，连接产物没连上，感受态有问题，建议你系统的做一个对照，把以上因素考虑进去就行了
仔细点说就是用实验已有抗性的菌划你那板，看板有没问题（我个人觉得你板上没长东西看你抗生素浓度加对没？别加太高）
用一个相同抗性的质粒转感受态，看感受态效率（自己网上百度，怎么算效率，要高于一定程度，做连接才比较成功）
如果以上都没问题就是你连接到问题了
板一晚上没长出来，如果延迟到中午还没有就别要了，过几天长的那都是杂菌
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9楼2014-06-18 13:00:44
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

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★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-19 09:17:14
重新做感受态吧，或者用control insert 做一次试试
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
10楼2014-06-18 14:28:12
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