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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 昆虫基因PCR后电泳条带淡，急求帮助？？？？
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高照李

木虫 (正式写手)

[求助] 昆虫基因PCR后电泳条带淡，急求帮助？？？？

我在做几种昆虫的DNA线粒体DNA COI片段，目的基因大小约600-700bp,用pcr扩增COI片段，50μl的扩增反应体系是：
Premix Ex Taq   25μl
引物1（LCO1490)（10μM）2μl
引物2 (HCO2198)（10μM）2μl
模板1μl（<50ng）1~4μ不等，浓度在150~300ng/ul。
加水至50ul。
   PCR反应程序：95度10min。94℃预变性3min，94℃变性60s，44℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环，循环结束后，72℃延伸10min。
图中显示有的条带太暗了而且有的有弥散，引物正常。做过退火温度的梯度实验，有出来的条带但很淡。今晚做的条带更淡且有弥散。请问我该怎么调？
另外昨天做实验时水加少了，结果有的种类出来了，请问是预混酶浓度变化的问题吗？不知道哪位高人能帮帮分析一下？

未标题-2.jpg
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1楼 2013-02-01 19:47:22
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1989zb

金虫 (小有名气)
一样啊 我一直做 一直都是条带暗 各种条件变了都一样
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3楼2013-03-18 21:48:59
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hpzhao1980

新虫 (初入文坛)
你比我强，我做了一天发现没有跑出一个条带！！！！！
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2楼2013-03-18 21:02:12
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gastropoda

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

个人建意加大Taq酶的量试一下.
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4楼2013-04-11 14:09:44
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1279341226

新虫 (初入文坛)
我现在正在做寄生蜂的这个该片段，用的同样的引物，不知道是不是虫子太小，而且用的是无损伤提取方法，连很淡的条带都没有，请问前辈做的是哪几种虫子呀，求助哇。。。
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5楼2015-04-06 21:07:15
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