应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » RED重组敲除基因，PCR验证时既有目的基因条带也有打靶片段条带
191/2返回列表12下一页
查看: 4781  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

emmaya

新虫 (初入文坛)

[求助] RED重组敲除基因，PCR验证时既有目的基因条带也有打靶片段条带 已有4人参与

如题，欲敲除的是大肠杆菌K-12的C600分子伴侣GroEL基因，大小约为1700bp。用RED重组方法，电转入两边各带50bp同源臂的线性片段（大小约1100bp）后，对筛选出来的疑似敲除菌株抽基因组PCR验证。

引物为目的基因5’、3’端，扩增出来的条带有两条，既有没敲掉的原基因大小，也有线性片段的条带。

在目的基因上游和线性片段中间设计的一对引物，则只有一条带，且大小正确，理论上来讲线性片段应该交换到基因组上了；

对目的基因非同源臂部分，设计了一对引物，疑似敲除的菌株与原始菌扩增出来的条带大小一样，说明目的基因还在。

想请教，这个情况到底是为什么呢，怎么会两种情况同时出现，不是应该要么线性片段交换上要么没有吗？

不知道问题出在哪里，有没有大牛有相似的经历的，什么办法可以解决呢？求给点意见！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-03-27 09:49:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
99%的可能性是染菌了
赞一下 回复此楼
相信自己
2楼2014-03-27 12:38:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

emmaya

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-03-27 12:38:10
99%的可能性是染菌了

起初也怀疑是染菌了，我是用50ug/ml氯霉素筛选出来的单菌落，然后用同样的抗性摇菌，抽的基因组进行PCR的，这样还有可能是因为染菌吗？
赞一下 回复此楼
3楼2014-03-27 16:02:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

emmaya

新虫 (初入文坛)
求助呀
回复此楼
4楼2014-03-29 18:21:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

l68266152

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by emmaya at 2014-03-27 16:02:06
起初也怀疑是染菌了，我是用50ug/ml氯霉素筛选出来的单菌落，然后用同样的抗性摇菌，抽的基因组进行PCR的，这样还有可能是因为染菌吗？...

仔细看了下，有可能是单交换，可以在目的基因“下游”和线性片段中间设计的一对引物，测试。
赞一下 回复此楼
相信自己
5楼2014-03-31 12:46:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

红塔山和云烟

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在距离目的基因上下游各约100bp处设计引物，以抽提的基因组为模板，PCR扩增，得到的目的片段进行测序
赞一下 回复此楼
6楼2014-05-06 16:17:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

韩蕾6862

新虫 (初入文坛)
你现在找到原因了吗？我也遇到了相同的问题
赞一下 回复此楼
7楼2014-11-29 16:14:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

emmaya

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 韩蕾6862 at 2014-11-29 16:14:07
你现在找到原因了吗？我也遇到了相同的问题

没有找到原因，听虫友说这样的只能通过反复不断的尝试才可能获得正确的敲除菌，可以尝试不同的同源臂，能敲除的概率比较低
赞一下 回复此楼
8楼2014-11-30 15:59:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

浅语8905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

两边各带50bp同源臂的线性片段pcR的模板线性的吗？如果不是线性会造成很多假阳性。但也可能是错配造成的
赞一下 回复此楼
9楼2015-01-30 12:26:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huyuan9701

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 韩蕾6862 at 2014-11-29 16:14:07
你现在找到原因了吗？我也遇到了相同的问题

我也遇到相同问题，不知道你们解决了没有啊？
赞一下 回复此楼
10楼2015-05-12 20:34:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 emmaya 的主题更新
191/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 15/750 2026-11-06 13:49 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 17/850 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 11/550 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:36 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 10/500 2026-11-06 12:32 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 12/600 2026-11-06 05:32 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 04:47 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 04:47 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 8/400 2026-11-06 02:24 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:15 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:02 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 10/500 2026-11-06 01:51 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:42 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭