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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » RED重组敲除基因，PCR验证时既有目的基因条带也有打靶片段条带
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emmaya

新虫 (初入文坛)

[求助] RED重组敲除基因，PCR验证时既有目的基因条带也有打靶片段条带 已有4人参与

如题，欲敲除的是大肠杆菌K-12的C600分子伴侣GroEL基因，大小约为1700bp。用RED重组方法，电转入两边各带50bp同源臂的线性片段（大小约1100bp）后，对筛选出来的疑似敲除菌株抽基因组PCR验证。

引物为目的基因5’、3’端，扩增出来的条带有两条，既有没敲掉的原基因大小，也有线性片段的条带。

在目的基因上游和线性片段中间设计的一对引物，则只有一条带，且大小正确，理论上来讲线性片段应该交换到基因组上了；

对目的基因非同源臂部分，设计了一对引物，疑似敲除的菌株与原始菌扩增出来的条带大小一样，说明目的基因还在。

想请教，这个情况到底是为什么呢，怎么会两种情况同时出现，不是应该要么线性片段交换上要么没有吗？

不知道问题出在哪里，有没有大牛有相似的经历的，什么办法可以解决呢？求给点意见！
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1楼 2014-03-27 09:49:15
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
99%的可能性是染菌了
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相信自己
2楼2014-03-27 12:38:10
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emmaya

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-03-27 12:38:10
99%的可能性是染菌了

起初也怀疑是染菌了，我是用50ug/ml氯霉素筛选出来的单菌落，然后用同样的抗性摇菌，抽的基因组进行PCR的，这样还有可能是因为染菌吗？
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3楼2014-03-27 16:02:06
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emmaya

新虫 (初入文坛)
求助呀
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4楼2014-03-29 18:21:16
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l68266152

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by emmaya at 2014-03-27 16:02:06
起初也怀疑是染菌了，我是用50ug/ml氯霉素筛选出来的单菌落，然后用同样的抗性摇菌，抽的基因组进行PCR的，这样还有可能是因为染菌吗？...

仔细看了下，有可能是单交换，可以在目的基因“下游”和线性片段中间设计的一对引物，测试。
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相信自己
5楼2014-03-31 12:46:18
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红塔山和云烟

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在距离目的基因上下游各约100bp处设计引物，以抽提的基因组为模板，PCR扩增，得到的目的片段进行测序
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6楼2014-05-06 16:17:42
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韩蕾6862

新虫 (初入文坛)
你现在找到原因了吗？我也遇到了相同的问题
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7楼2014-11-29 16:14:07
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emmaya

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 韩蕾6862 at 2014-11-29 16:14:07
你现在找到原因了吗？我也遇到了相同的问题

没有找到原因，听虫友说这样的只能通过反复不断的尝试才可能获得正确的敲除菌，可以尝试不同的同源臂，能敲除的概率比较低
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8楼2014-11-30 15:59:55
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浅语8905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

两边各带50bp同源臂的线性片段pcR的模板线性的吗？如果不是线性会造成很多假阳性。但也可能是错配造成的
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9楼2015-01-30 12:26:00
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huyuan9701

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 韩蕾6862 at 2014-11-29 16:14:07
你现在找到原因了吗？我也遇到了相同的问题

我也遇到相同问题，不知道你们解决了没有啊？
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10楼2015-05-12 20:34:33
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