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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重组质粒目的基因PCR
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒目的基因PCR 已有1人参与

重组质粒，PCR，电泳图成这样了，师兄说这是错配，完全看不懂是怎么回事啊，求大神指教啊
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  • 附件 1 : 重组质粒PCR电泳.tif
    • 2014-03-24 12:12:11, 2.76 M

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1楼 2014-03-24 12:20:51
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-24 18:50:09
请问你点了几微升样？如果是点两微升，PCR产物应该比较亮，你没有点阴性对照，原质粒PCR参照条带也没有，不好分析。
希望对你有帮助
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2楼2014-03-24 15:55:28
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-03-24 15:55:28
请问你点了几微升样？如果是点两微升，PCR产物应该比较亮，你没有点阴性对照，原质粒PCR参照条带也没有，不好分析。
希望对你有帮助

阴性对照是什么？原质粒PCR参照条带是指空质粒PCR么？求指教啊，谢谢
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3楼2014-03-25 08:59:32
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-03-24 15:55:28
请问你点了几微升样？如果是点两微升，PCR产物应该比较亮，你没有点阴性对照，原质粒PCR参照条带也没有，不好分析。
希望对你有帮助

点了五微升的样还是这样，师兄说可能是引物错配啊什么的
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4楼2014-03-25 09:14:58
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 笑笑打dota at 2014-03-25 08:59:32
阴性对照是什么？原质粒PCR参照条带是指空质粒PCR么？求指教啊，谢谢...

阴性对照就是PCR的时候，对应一管不加模版，这样可以看你引物，DDH2O,Buffer,酶，dNTP有没有被污染。
原质粒PCR参照条带是指你连接到重组质粒上的PCR产物，跑电泳时点上可以对应比较。
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5楼2014-03-25 12:10:02
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 笑笑打dota at 2014-03-25 09:14:58
点了五微升的样还是这样，师兄说可能是引物错配啊什么的...

可以把你的重组质粒用相应的酶切，看切出来的片段大小对不对
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6楼2014-03-25 12:14:53
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-03-25 12:10:02
阴性对照就是PCR的时候，对应一管不加模版，这样可以看你引物，DDH2O,Buffer,酶，dNTP有没有被污染。
原质粒PCR参照条带是指你连接到重组质粒上的PCR产物，跑电泳时点上可以对应比较。...

哦，懂了。非常感谢啊。我还想问下，是我没说清楚，我的电泳图就是重组质粒后PCR跑的电泳，那不是跟你说的原质粒PCR参照条带是一个意思了？
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7楼2014-03-25 16:14:54
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-03-25 12:14:53
可以把你的重组质粒用相应的酶切，看切出来的片段大小对不对...

听师兄说用单酶切的话，也会切出很多条带，会酶切不完全，请问会出现这种情况吗？
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8楼2014-03-25 16:16:35
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 笑笑打dota at 2014-03-25 16:16:35
听师兄说用单酶切的话，也会切出很多条带，会酶切不完全，请问会出现这种情况吗？...

是会有很多条带，一个质粒上的单酶切位点有的不止一个，你只要知道你构建的这个质粒的酶切位点有哪些，根据酶切位点选择一种酶来切，看是否能切下相应大小的片段（相应大小的片段是指该酶挨着的酶切位点之间的碱基数），将它和用同种酶切的原质粒比较即可，我一般选Hind III酶切。
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9楼2014-03-27 14:04:30
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