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笑笑打dota

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒目的基因PCR 已有1人参与

重组质粒,PCR,电泳图成这样了,师兄说这是错配,完全看不懂是怎么回事啊,求大神指教啊
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  • 附件 1 : 重组质粒PCR电泳.tif
  • 2014-03-24 12:12:11, 2.76 M

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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-03-24 18:50:09
请问你点了几微升样?如果是点两微升,PCR产物应该比较亮,你没有点阴性对照,原质粒PCR参照条带也没有,不好分析。
希望对你有帮助
2楼2014-03-24 15:55:28
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-03-24 15:55:28
请问你点了几微升样?如果是点两微升,PCR产物应该比较亮,你没有点阴性对照,原质粒PCR参照条带也没有,不好分析。
希望对你有帮助

阴性对照是什么?原质粒PCR参照条带是指空质粒PCR么?求指教啊,谢谢
3楼2014-03-25 08:59:32
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-03-24 15:55:28
请问你点了几微升样?如果是点两微升,PCR产物应该比较亮,你没有点阴性对照,原质粒PCR参照条带也没有,不好分析。
希望对你有帮助

点了五微升的样还是这样,师兄说可能是引物错配啊什么的
4楼2014-03-25 09:14:58
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 笑笑打dota at 2014-03-25 08:59:32
阴性对照是什么?原质粒PCR参照条带是指空质粒PCR么?求指教啊,谢谢...

阴性对照就是PCR的时候,对应一管不加模版,这样可以看你引物,DDH2O,Buffer,酶,dNTP有没有被污染。
原质粒PCR参照条带是指你连接到重组质粒上的PCR产物,跑电泳时点上可以对应比较。
5楼2014-03-25 12:10:02
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 笑笑打dota at 2014-03-25 09:14:58
点了五微升的样还是这样,师兄说可能是引物错配啊什么的...

可以把你的重组质粒用相应的酶切,看切出来的片段大小对不对
6楼2014-03-25 12:14:53
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-03-25 12:10:02
阴性对照就是PCR的时候,对应一管不加模版,这样可以看你引物,DDH2O,Buffer,酶,dNTP有没有被污染。
原质粒PCR参照条带是指你连接到重组质粒上的PCR产物,跑电泳时点上可以对应比较。...

哦,懂了。非常感谢啊。我还想问下,是我没说清楚,我的电泳图就是重组质粒后PCR跑的电泳,那不是跟你说的原质粒PCR参照条带是一个意思了?
7楼2014-03-25 16:14:54
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-03-25 12:14:53
可以把你的重组质粒用相应的酶切,看切出来的片段大小对不对...

听师兄说用单酶切的话,也会切出很多条带,会酶切不完全,请问会出现这种情况吗?
8楼2014-03-25 16:16:35
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 笑笑打dota at 2014-03-25 16:16:35
听师兄说用单酶切的话,也会切出很多条带,会酶切不完全,请问会出现这种情况吗?...

是会有很多条带,一个质粒上的单酶切位点有的不止一个,你只要知道你构建的这个质粒的酶切位点有哪些,根据酶切位点选择一种酶来切,看是否能切下相应大小的片段(相应大小的片段是指该酶挨着的酶切位点之间的碱基数),将它和用同种酶切的原质粒比较即可,我一般选Hind III酶切。
9楼2014-03-27 14:04:30
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