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PET-32A重组质粒构建 已有2人参与
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| 最近在重组质粒，遇上很多问题。首先就是我每次抽提质粒的浓度总是很低。然后我那浓度低的质粒双酶切（Ecor1和xho1)后和目的基因连接。挑菌后菌液PCR，条带比较弱，我担心是假阳性，就抽提质粒后用带目的基因的引物做了PCR，条带很亮，大小也对。然后双酶切了，目的基因片段附近有点弱弱的条带，我还不放心，就拿空质粒和我认为的重组质粒跑了胶，一看，重组质粒比较大，而且大小片段应该对。。然后测序。测序结果是空质粒！！！！！！！！！！！我该怎么办？从哪开始重做？？ |
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luwei13566
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-12-26 08:29:38
ptccc: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 谢谢~ 2013-12-26 21:42:58
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1.提质粒浓度低 有可能是你提质粒没提好，细胞壁没破开，如果手提质粒不熟练就用试剂盒吧，也有可能是你保存质粒的菌染菌了~，接菌的培养基加抗性了吗？如果在加抗性的培养基里摇出来的菌提质粒还是浓度低，那就用你提出来的浓度低的质粒用不同的宿主菌再重新转化一下，保存质粒的菌株是JM109还是DH5a？？ 2.你用浓度很低的质粒和基因同时双酶切后处理了吗，比如割胶回收或者纯化？？还是直接混在一起酶连了？ 3.酶连后转化，你的感受态细胞做的怎么样？涂板的平板抗性加够了吗？？挑出来的转化子提质粒浓度还低？你平板上的转化子长得怎么样，整个平板上都是小的单菌落转化子吗？你从你的筛选平板上挑单菌落接试管的同时扎板保存了吗？扎的板子上的菌落长得怎么样？ 4.你用PCR来验证重组质粒只能说明你的转化子里的质粒里含有重组质粒，而不能证明纯度，你双酶切后目的条带处很弱有两个可能：一是你双酶切处理的不彻底，就是酶切时间不够长，再者就是你的质粒不纯，咱们跑的琼脂糖凝胶是有个分辨率的，胶上看不见的不一定没有。从测序结果上也可以看出这一点。~因此，你从转化子里提的质粒是重组质粒和空载质粒的混合物，~而且你的重组质粒貌似要比空载的多一些~~ 解决的办法很简单，就拿你从转化子里提的质粒重新做一下转化，换个宿主菌做感受态，以前是BL21的话可以先用个DH5a或者JM109（你一定要确认你的菌没有染杂菌），转化后涂板再筛一次转化子，一定要挑单菌落~再提一下质粒看看，如果跑的胶很亮，大小也对（想做酶切验证也可以），就可以送测序，转化子就可以保存个甘油管这样重组质粒就保存好了，如果想表达直接提重组质粒转化BL21就行了，顺便说一句，从LZ描述的情况看，你的菌有必要做个全面筛查，我估计你保存的好多菌都不太可靠特别是BL21，实在不行就扔了问别人借一下 |
4楼2013-12-26 02:06:38
b6122
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5楼2013-12-26 02:11:41
cicelyzh
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