应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PET-32A重组质粒构建
211/3返回列表123下一页
查看: 3450  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

ptccc

铜虫 (初入文坛)

[求助] PET-32A重组质粒构建 已有2人参与

最近在重组质粒，遇上很多问题。首先就是我每次抽提质粒的浓度总是很低。然后我那浓度低的质粒双酶切（Ecor1和xho1)后和目的基因连接。挑菌后菌液PCR，条带比较弱，我担心是假阳性，就抽提质粒后用带目的基因的引物做了PCR，条带很亮，大小也对。然后双酶切了，目的基因片段附近有点弱弱的条带，我还不放心，就拿空质粒和我认为的重组质粒跑了胶，一看，重组质粒比较大，而且大小片段应该对。。然后测序。测序结果是空质粒！！！！！！！！！！！我该怎么办？从哪开始重做？？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-12-25 23:38:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-12-26 08:29:38
ptccc: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 谢谢~ 2013-12-26 21:42:58
1.提质粒浓度低 有可能是你提质粒没提好，细胞壁没破开，如果手提质粒不熟练就用试剂盒吧，也有可能是你保存质粒的菌染菌了~，接菌的培养基加抗性了吗？如果在加抗性的培养基里摇出来的菌提质粒还是浓度低，那就用你提出来的浓度低的质粒用不同的宿主菌再重新转化一下，保存质粒的菌株是JM109还是DH5a？？
2.你用浓度很低的质粒和基因同时双酶切后处理了吗，比如割胶回收或者纯化？？还是直接混在一起酶连了？
3.酶连后转化，你的感受态细胞做的怎么样？涂板的平板抗性加够了吗？？挑出来的转化子提质粒浓度还低？你平板上的转化子长得怎么样，整个平板上都是小的单菌落转化子吗？你从你的筛选平板上挑单菌落接试管的同时扎板保存了吗？扎的板子上的菌落长得怎么样？
4.你用PCR来验证重组质粒只能说明你的转化子里的质粒里含有重组质粒，而不能证明纯度，你双酶切后目的条带处很弱有两个可能：一是你双酶切处理的不彻底，就是酶切时间不够长，再者就是你的质粒不纯，咱们跑的琼脂糖凝胶是有个分辨率的，胶上看不见的不一定没有。从测序结果上也可以看出这一点。~因此，你从转化子里提的质粒是重组质粒和空载质粒的混合物，~而且你的重组质粒貌似要比空载的多一些~~

解决的办法很简单，就拿你从转化子里提的质粒重新做一下转化，换个宿主菌做感受态，以前是BL21的话可以先用个DH5a或者JM109（你一定要确认你的菌没有染杂菌），转化后涂板再筛一次转化子，一定要挑单菌落~再提一下质粒看看，如果跑的胶很亮，大小也对（想做酶切验证也可以），就可以送测序，转化子就可以保存个甘油管这样重组质粒就保存好了，如果想表达直接提重组质粒转化BL21就行了，顺便说一句，从LZ描述的情况看，你的菌有必要做个全面筛查，我估计你保存的好多菌都不太可靠特别是BL21，实在不行就扔了问别人借一下
赞一下(1人) 回复此楼
大家相互帮助哈
4楼2013-12-26 02:06:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

b6122

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-26 08:29:31
ptccc: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-12-26 22:01:39
你先检查一下是不是菌种悲剧了。划个带抗生素的板子重新挑个菌落做一下，或者重新转化挑菌落。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2013-12-26 00:18:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

youngyyf

新虫 (小有名气)
好悲催

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
既然选择了远方便只顾风雨兼程
3楼2013-12-26 00:41:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-26 02:06:38
1.提质粒浓度低 有可能是你提质粒没提好，细胞壁没破开，如果手提质粒不熟练就用试剂盒吧，也有可能是你保存质粒的菌染菌了~，接菌的培养基加抗性了吗？如果在加抗性的培养基里摇出来的菌提质粒还是浓度低，那就用你 ...

顺便提一句，用质粒转化的时候质粒不要加多了0.5ul就足够了，如果你的质粒浓度低的话1ul也够了，不然满板的转化子甚至整个平板都是白的。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
5楼2013-12-26 02:11:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-12-26 08:29:44
pET系列的表达载体不是高拷贝质粒，所以质粒浓度不高是正常的。你可以多收些菌裂解，用一个柱子吸附，应该得到浓度可以的质粒。
如果你确定重组质粒没有问题，有可能是测序的事情，一般多送几个克隆。鉴定时双酶切和单酶切都要做，同时用空载体做对照。双酶切看到目标条带，单酶切后重组质粒比空载体大，并与marker的分子量进行比对。未经酶切的质粒大小不好与marker比较。
赞一下 回复此楼
6楼2013-12-26 03:31:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ptccc

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-26 02:06:38
1.提质粒浓度低 有可能是你提质粒没提好，细胞壁没破开，如果手提质粒不熟练就用试剂盒吧，也有可能是你保存质粒的菌染菌了~，接菌的培养基加抗性了吗？如果在加抗性的培养基里摇出来的菌提质粒还是浓度低，那就用你 ...

我也怀疑是我的培养基抗生素失效了，今天拿板子直接放37度培养，长了菌。然后我就重新找别人要了Pet32a拿来划线挑菌了，看来是一点懒都不能偷。我今天还重新配了所有的培养基!睡一觉醒来我就不绝望了。今天我还连接了pPICZα，实验室都做真核，我本来嫌麻烦所以做原核，但是实验室做原核的质粒什么的太少了，而且出问题了不知道问谁。

谢谢你的回答。
赞一下 回复此楼
7楼2013-12-26 21:49:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ptccc

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by youngyyf at 2013-12-26 00:41:21
好悲催


今天早上起来我满血复活了。
赞一下 回复此楼
8楼2013-12-26 21:49:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ptccc

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by b6122 at 2013-12-26 00:18:00
你先检查一下是不是菌种悲剧了。划个带抗生素的板子重新挑个菌落做一下，或者重新转化挑菌落。

思前想后，我就是当时没有划板子直接摇菌。我今天已经重新画板子了。谢谢你的回复~
赞一下 回复此楼
9楼2013-12-26 21:50:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ptccc

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-26 02:06:38
1.提质粒浓度低 有可能是你提质粒没提好，细胞壁没破开，如果手提质粒不熟练就用试剂盒吧，也有可能是你保存质粒的菌染菌了~，接菌的培养基加抗性了吗？如果在加抗性的培养基里摇出来的菌提质粒还是浓度低，那就用你 ...

再问一句，什么是扎板保存？就是把挑完菌的平板留起来吗？
赞一下 回复此楼
10楼2013-12-26 21:51:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ptccc 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭