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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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ptccc

铜虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-26 02:11:41
顺便提一句，用质粒转化的时候质粒不要加多了0.5ul就足够了，如果你的质粒浓度低的话1ul也够了，不然满板的转化子甚至整个平板都是白的。...

我已经悲剧了。。上次质粒转化时我加了3ul。。。。找不到单菌落。。
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11楼2013-12-26 21:53:44
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铜虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-26 03:31:41
pET系列的表达载体不是高拷贝质粒，所以质粒浓度不高是正常的。你可以多收些菌裂解，用一个柱子吸附，应该得到浓度可以的质粒。
如果你确定重组质粒没有问题，有可能是测序的事情，一般多送几个克隆。鉴定时双酶切 ...

我送了好几个样，换了公司都一样。应该是我的问题，不是测序公司的问题。单酶切没试过。我可以试试看。谢谢回复
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12楼2013-12-26 22:00:36
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by ptccc at 2013-12-26 21:49:01
我也怀疑是我的培养基抗生素失效了，今天拿板子直接放37度培养，长了菌。然后我就重新找别人要了Pet32a拿来划线挑菌了，看来是一点懒都不能偷。我今天还重新配了所有的培养基!睡一觉醒来我就不绝望了。今天我还连接 ...

原核有原核的优势。让我来说如果能做原核我也做原核。你实验效率不错啊，昨天做原核今天就连Za了啊，重组质粒构建好了吗？对了，你们酵母转化用的是什么方法转化？还有你们Zeocin抗性平板倒平板的时候需要避光吗？是100ug/ml吗？平时你们的抗Zeocin性平板都怎么保存的啊，快被这个抗生素坑死了
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13楼2013-12-26 22:02:55
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by ptccc at 2013-12-26 21:51:55
再问一句，什么是扎板保存？就是把挑完菌的平板留起来吗？...

一般你扎一个枪头往试管转接前，先在另一个平板上扎一下，等于就把你的转化子保存在另一个平板上！
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14楼2013-12-26 22:04:53
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铜虫 (初入文坛)
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13楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-26 22:02:55
原核有原核的优势。让我来说如果能做原核我也做原核。你实验效率不错啊，昨天做原核今天就连Za了啊，重组质粒构建好了吗？对了，你们酵母转化用的是什么方法转化？还有你们Zeocin抗性平板倒平板的时候需要避光吗？ ...

之前就是有弄好真核跟原核的酶切位点，双酶切也做好了。昨天就直接连接了Za了，连没连上我就得明天才知道了。我们酵母电转的，倒平板没有避光，当时有个比较黑暗的超净工作台。浓度也是跟Amp一样的倒好了就用锡纸封起来。他们全都做真核，觉得我的原核特别低端。。。。今天还跟我说，做什么原核，没出息。晕死。还有师姐说，原核很烦。。。我也不明白，原核怎么烦了。就是什么都得自己配，没得共用
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15楼2013-12-27 09:26:28
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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15楼: Originally posted by ptccc at 2013-12-27 09:26:28
之前就是有弄好真核跟原核的酶切位点，双酶切也做好了。昨天就直接连接了Za了，连没连上我就得明天才知道了。我们酵母电转的，倒平板没有避光，当时有个比较黑暗的超净工作台。浓度也是跟Amp一样的倒好了就用锡纸封 ...

怎么会低端，做原核周期非常短，而且后期验证很容易，诱导表达很快就能出酶，而酵母就不行了，整合后验证这个验证那个，诱导表达至少半个星期，中途还要一直补加甲醇，不注意就容易染菌，论工程菌，大肠杆菌当之无愧是老大，优势是没法比的，一般策略都是先原核来一轮，诱导的蛋白如果没活性或者包涵体了，才去再考虑真核~~
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16楼2013-12-27 09:37:40
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铜虫 (初入文坛)
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16楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-27 09:37:40
怎么会低端，做原核周期非常短，而且后期验证很容易，诱导表达很快就能出酶，而酵母就不行了，整合后验证这个验证那个，诱导表达至少半个星期，中途还要一直补加甲醇，不注意就容易染菌，论工程菌，大肠杆菌当之无 ...

就是担心没活性，才说转真核。但是我倒是担心做真核表达不出来怎么办。我个人还是倾向原核。我们老板也说原核这块也要有人做。但是我一个重组质粒都构建不好，还有什么好做的。。。哎。。。。我都想退学了~~
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17楼2013-12-27 14:07:50
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luwei13566

木虫 (正式写手)
晕，按照LZ的说法我都该退学几十次了。。。。做实验哪有几个顺利的，要是顺利那就不是实验了，你要表达的蛋白来源是哪里，有信号肽没？有内含子吗~？先把菌株筛查一遍，构建原核重组质粒不难，~
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18楼2013-12-27 20:13:52
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铜虫 (初入文坛)
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18楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-27 20:13:52
晕，按照LZ的说法我都该退学几十次了。。。。做实验哪有几个顺利的，要是顺利那就不是实验了，你要表达的蛋白来源是哪里，有信号肽没？有内含子吗~？先把菌株筛查一遍，构建原核重组质粒不难，~

我已经构建真核质粒成功了。做真核好了
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19楼2013-12-31 11:15:28
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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19楼: Originally posted by ptccc at 2013-12-31 11:15:28
我已经构建真核质粒成功了。做真核好了...

祝你实验顺利
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20楼2013-12-31 14:50:34
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