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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PET-32A重组质粒构建
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ptccc

铜虫 (初入文坛)

[求助] PET-32A重组质粒构建 已有2人参与

最近在重组质粒，遇上很多问题。首先就是我每次抽提质粒的浓度总是很低。然后我那浓度低的质粒双酶切（Ecor1和xho1)后和目的基因连接。挑菌后菌液PCR，条带比较弱，我担心是假阳性，就抽提质粒后用带目的基因的引物做了PCR，条带很亮，大小也对。然后双酶切了，目的基因片段附近有点弱弱的条带，我还不放心，就拿空质粒和我认为的重组质粒跑了胶，一看，重组质粒比较大，而且大小片段应该对。。然后测序。测序结果是空质粒！！！！！！！！！！！我该怎么办？从哪开始重做？？
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1楼 2013-12-25 23:38:37
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ptccc

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by luwei13566 at 2013-12-26 22:02:55
原核有原核的优势。让我来说如果能做原核我也做原核。你实验效率不错啊，昨天做原核今天就连Za了啊，重组质粒构建好了吗？对了，你们酵母转化用的是什么方法转化？还有你们Zeocin抗性平板倒平板的时候需要避光吗？ ...

之前就是有弄好真核跟原核的酶切位点，双酶切也做好了。昨天就直接连接了Za了，连没连上我就得明天才知道了。我们酵母电转的，倒平板没有避光，当时有个比较黑暗的超净工作台。浓度也是跟Amp一样的倒好了就用锡纸封起来。他们全都做真核，觉得我的原核特别低端。。。。今天还跟我说，做什么原核，没出息。晕死。还有师姐说，原核很烦。。。我也不明白，原核怎么烦了。就是什么都得自己配，没得共用
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15楼2013-12-27 09:26:28
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b6122

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-26 08:29:31
ptccc: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-12-26 22:01:39
你先检查一下是不是菌种悲剧了。划个带抗生素的板子重新挑个菌落做一下，或者重新转化挑菌落。

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2楼2013-12-26 00:18:00
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youngyyf

新虫 (小有名气)
好悲催

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既然选择了远方便只顾风雨兼程
3楼2013-12-26 00:41:21
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-12-26 08:29:38
ptccc: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 谢谢~ 2013-12-26 21:42:58
1.提质粒浓度低 有可能是你提质粒没提好，细胞壁没破开，如果手提质粒不熟练就用试剂盒吧，也有可能是你保存质粒的菌染菌了~，接菌的培养基加抗性了吗？如果在加抗性的培养基里摇出来的菌提质粒还是浓度低，那就用你提出来的浓度低的质粒用不同的宿主菌再重新转化一下，保存质粒的菌株是JM109还是DH5a？？
2.你用浓度很低的质粒和基因同时双酶切后处理了吗，比如割胶回收或者纯化？？还是直接混在一起酶连了？
3.酶连后转化，你的感受态细胞做的怎么样？涂板的平板抗性加够了吗？？挑出来的转化子提质粒浓度还低？你平板上的转化子长得怎么样，整个平板上都是小的单菌落转化子吗？你从你的筛选平板上挑单菌落接试管的同时扎板保存了吗？扎的板子上的菌落长得怎么样？
4.你用PCR来验证重组质粒只能说明你的转化子里的质粒里含有重组质粒，而不能证明纯度，你双酶切后目的条带处很弱有两个可能：一是你双酶切处理的不彻底，就是酶切时间不够长，再者就是你的质粒不纯，咱们跑的琼脂糖凝胶是有个分辨率的，胶上看不见的不一定没有。从测序结果上也可以看出这一点。~因此，你从转化子里提的质粒是重组质粒和空载质粒的混合物，~而且你的重组质粒貌似要比空载的多一些~~

解决的办法很简单，就拿你从转化子里提的质粒重新做一下转化，换个宿主菌做感受态，以前是BL21的话可以先用个DH5a或者JM109（你一定要确认你的菌没有染杂菌），转化后涂板再筛一次转化子，一定要挑单菌落~再提一下质粒看看，如果跑的胶很亮，大小也对（想做酶切验证也可以），就可以送测序，转化子就可以保存个甘油管这样重组质粒就保存好了，如果想表达直接提重组质粒转化BL21就行了，顺便说一句，从LZ描述的情况看，你的菌有必要做个全面筛查，我估计你保存的好多菌都不太可靠特别是BL21，实在不行就扔了问别人借一下
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大家相互帮助哈
4楼2013-12-26 02:06:38
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